血浆游离HPV-DNA在宫颈癌中的临床价值

赵兰静,黄学文,潘 杰,吴 茵

1．华东疗养院检验科，江苏无锡 214065；2．江苏省无锡市第二人民医院检验科，江苏无锡 214002

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，严重威胁女性健康。近年来，宫颈癌的发病人群逐渐呈现年轻化趋势[1]。高危人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染是宫颈癌发生的主要病因。有研究表明，HPV16型和HPV18型与宫颈癌密切相关[2]。血浆游离HPV-DNA的检测阳性率低，国内外学者对血浆游离HPV-DNA与宫颈癌相关性进行了较多研究，但是结果仍存有争议[3-5]。本研究应用PCR-反向斑点杂交技术(PCR-RDB)方法检测外周血HPV-DNA及其亚型，旨在探讨血浆游离HPV16型/HPV18型在宫颈癌中的临床价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2016年1月至2019年2月在无锡市第二人民医院(以下称“本院”)行阴道镜活检患者的病例资料，共184例。根据病理活检结果将184例研究对象分为4组：(1)宫颈癌组(CC组)58例；(2)宫颈高度病变组(HG组)47例，包括宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅱ～Ⅲ 级；(3)宫颈低度病变组(LG组)39例，即CINⅠ级；(4)宫颈炎组(IC组)40例。另选取40例健康体检者作为对照(NC)组。所有患者年龄22～67岁，平均年龄(40.15±8.34)岁。

1.2纳入标准 所有病例均经该院病理科确诊；符合国际妇产科联盟(FIGO)分类标准和WHO分级标准，CC组患者均为原发性肿瘤；既往均未接受放疗、化疗且半年内未接受过激素类药物治疗；经检查排除远处转移且无严重的慢性肾病及肝病者；经病理证实，组织学分类清晰者。对照组均为同期于本院进行体检的健康人群。

1.3标本处理 分别抽取上述患者治疗前及对照组研究对象的外周血2 mL，EDTA抗凝，3 000 r/min离心10 min，吸取上层血浆至对应编号的EP管中；13 000 r/min离心10 min，小心吸取上清液至新编号的对应EP管中，-80 ℃保存备用。

1.4仪器与试剂 Micromax微量离心机(美国Thermo公司)，Bioer MB-102恒温振荡金属浴(杭州博日公司)，ABI VERITI梯度PCR仪(美国Life公司)，超级恒温循环槽(上海一恒科学仪器有限公司)，BYN-H16杂交仪(亚能公司)。多重PCR试剂盒(江苏昱安生物科技有限公司)；尼龙膜(美国Pall公司)、杂交液(A液)、洗涤液1(B液)、洗涤液2(C液)由本实验室配置。

1.5方法

1.5.1血浆游离HPV-DNA的提取 采用国产磁珠法游离DNA提取试剂盒(江苏昱安生物科技有限公司)，取400 μL血浆标本按照说明书进行操作，最后用20 μL焦碳酸二乙酯处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水 (DEPC水)洗脱。提取产物于-80 ℃保存备用。

1.5.2引物和探针设计 基于HPV16型和HPV18型基因组E7区，用Primer Premier 5.0软件设计引物和探针。上、下游引物及杂交探针均由上海英骏公司合成。引物和探针设计见表1。

表1 引物和探针设计

1.5.3血浆游离HPV-DNA的扩增 采用多重PCR试剂盒(江苏昱安生物科技有限公司)对目的片段进行扩增。多重PCR反应体系如下：2×反应缓冲液12.5 μL，10 μmol/L HPV16型/HPV18型上、下游引物各0.5 μL，DEPC水5.5 μL，产物5 μL，总体积25 μL。PCR扩增条件：94 ℃ 1 min，1个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min，1个循环。

1.5.4PCR-RDB操作流程 制备固定有HPV16型和HPV18型探针的膜条。将标记好的膜条放入杂交管，加入杂交A液和PCR产物，100 ℃水浴变性10 min；51 ℃杂交1 h；B液洗膜5 min；抗体室温孵育30 min；A液洗涤2次，每次5 min；再用洗涤液2(C液)洗涤2 min，避光显色10 min，蒸馏水终止反应。HPV阳性判断为膜条相应位置出现肉眼可见的蓝色斑点。

1.6统计学处理 采用SPSS20.0软件对数据进行统计学处理及分析，计数资料以例数或百分率形式表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1血浆和组织病理学HPV-DNA检测结果的比较 与组织病理学的HPV检测结果比较，血浆中HPV16型单一感染的符合率为42.86%，HPV18型单一感染的符合率为13.04%，HPV16型/HPV18型双重感染的符合率为33.33%，HPV 16型/HPV 18型均阴性的标本中，符合率为97.94%。见表2。

表2 血浆和组织病理学HPV-DNA检测结果的比较

2.2各组宫颈病变患者血浆游离HPV-DNA的检测结果 血浆游离HPV-DNA在CC组的总检出率明显高于HG组、LG组及IC组，差异均有统计学意义(P<0.05)；对照组的40例健康体检者血浆中均未检测到HPV-DNA。见表3。

表3 各组患者外周血中HPV亚型的检出率[n(%)]

注，与CC组相比，*P<0.05。

3 讨 论

自肿瘤患者血浆病毒DNA水平高于健康人这一现象被发现后，肿瘤患者血浆病毒DNA逐渐成为人们研究的热点，但是关于宫颈癌患者血浆游离HPV-DNA的研究报道却很少。

HPV-DNA的入血机制有几种假设，包括肿瘤细胞坏死脱落、细胞凋亡和病毒颗粒释放以及非宫颈细胞来源的HPV-DNA[6-7]。本研究中CC组患者血浆游离HPV-DNA与肿瘤组织中的HPV-DNA具有相同基因型。这符合肿瘤细胞坏死脱落的假设。此外，IC组有2例患者血浆HPV16型为假阳性，提示HPV-DNA可能来源于非肿瘤组织。有研究发现，在乳腺癌、肺癌、口咽癌患者的血清或血浆中也可检测到HPV-DNA[8-10]，说明血浆游离HPV-DNA用于筛查宫颈癌的特异性较低。

本研究针对HPV E7区设计和优化引物，采用PCR-RDB检测血浆HPV-DNA，虽然CC组患者血浆游离HPV16型/HPV18型双重感染阳性率明显增加，但是总检出率仅为55.17%。2016年JEANNOT等[11]采用液滴数字PCR(ddPCR)方法对游离HPV-DNA的检测进行了改进，但对于那些早期宫颈癌患者仍然无法检测出HPV-DNA。这说明血浆游离HPV16型/HPV18型检测宫颈癌的灵敏度较低。分析原因可能是：(1)HPV-DNA释放入血的时间较迟或拷贝数太少，血浆游离HPV-DNA的浓度较低；(2)HPV的巨大异质性导致血浆中HPV-DNA引物可能存在错配，使扩增效率低下，甚至扩增失败；(3)HPV-DNA可能与宿主基因组发生整合，产生基因断裂、突变或丢失[12]。

表2结果表明，随着宫颈病变的加重，HPV16型/HPV18型双重感染阳性率不断增加，CC组检出率明显高于其他3组。这提示血浆游离HPV16型/HPV18型与宫颈癌的临床分期密切相关，检出率随分期增加而增高。此结果与其他研究结果一致[13]。

总之，血浆游离HPV-DNA具有简便、无创的特点，可以用于宫颈癌的辅助诊断，并且能够反映宫颈病变的严重程度。由于本研究只检测血浆中的HPV-DNA16型和18型，存在一定局限性，对于宫颈癌样本中其他型别可能存在漏检，并且检测血浆游离HPV16型/HPV18型的特异度与灵敏度均需进一步提高。如果能进一步扩大样本量，优化检测方法，进行长期的动态监测，相信血浆游离HPV16型/HPV18型的检测对于宫颈癌的筛查会具有更广阔的前景。