油茶象甲对油茶果实挥发物的触角电生理和行为反应*

曾家城 秦长生 赵丹阳 徐金柱 杨 华 田龙艳 邱华龙

(1.广东省肇庆市广宁县林业局，广东 肇庆 526500;2.广东省森林培育与保护利用重点实验室/广东省林业科学研究院，广东 广州 510520）

油茶（Camellia oleifera）是世界四大木本油料之一，是中国特有的一种纯天然高级油料，在林业、农渔、食疗、医药、化工、日化、轻纺等方面具有广泛的应用价值[1]。利用油茶果压榨出的茶油健康营养，气味清香，不仅不含芥酸、胆固醇、黄曲霉素等对人体有害的物质，而且具有抵抗紫外、延缓衰老、美容养颜、促进伤口愈合等诸多功效，被外界称赞为“世界上最好的食用油”[2-3]。随着茶油深加工技术的快速成熟发展，我国油茶种植、生产、深加工一体化全产业链体系正逐步形成并初具规模。根据国家林业局编制的《全国油茶产业发展规划（2009-2020）》，至2020 年全国油茶林面积将达到467 万hm2。随着油茶林面积和规模不断扩大，油茶病虫害的发生与危害也成日趋严重的态势，严重影响油茶的产量和品质，对山区油茶产业经济的健康发展和全面实现小康造成巨大威胁[4-6]。

油茶专性蛀果害虫油茶象甲（Curculio chinensis）的发生和危害是造成油茶低产低质的重要原因之一[7]。油茶象甲属于鞘翅目象甲科，广泛分布于我国云、贵、桂、浙、湘、赣、粤等油茶主产区，其虫态和危害状如图1 所示。油茶象甲成虫将卵产在油茶幼果的果仁内，卵孵化为幼虫后，幼虫蛀食果仁，果仁被食一空，导致油茶果早衰和落果。油茶象甲不仅产卵量较多，平均单头雌虫可产卵163 粒，而且为害期长，平均每年发生危害长达200 天左右[7]。油茶象甲幼虫隐蔽在油茶果内部蛀食果仁，当油茶果显示出症状时已暴发成灾，而化学药剂不容易渗透到果实内部，只有加大药剂使用量才能勉强提高防效。油茶作为木本油料树种，为社会提供健康营养的食用油料，大量使用化学药剂势必将危害人类的身体健康。因此，研究并应用更为安全、高效、无残留的油茶象甲防治技术势在必行。

图1 油茶象甲虫态及发生危害示意Fig. 1 Schematic diagrams of developmental states and its damaging phenomenon of Curculio chinensis

在昆虫与寄主植物的关系中，昆虫主要通过密布在触角上的化学感受器接收和识别植物源气味进行取食、寄主定位或产卵选择[8]。利用昆虫与植物的化学通讯机制进行害虫的预测预报及防治策略已在农林生产中得到应用：例如马铃薯（Solanum tuberosum）拉丁名释放的挥发物α-蒎烯、α-石竹烯、β-石竹烯、柠檬烯、月桂烯和烟碱对马铃薯块茎蛾（Phthorimaea operculella）的产卵具有显著的引诱作用，并依据该特性成功研发出马铃薯块茎蛾植物源高效引诱剂[9]。目前尚未见有关油茶象甲通过挥发物定位识别寄主植物的报道，因此，本研究分析了油茶果实挥发物对油茶象甲的电生理和行为反应，为油茶象甲引诱剂的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 油茶象甲采集与饲养

于2018 年4—8 月在广东省韶关市曲江区小坑林场和乐昌市龙山林场采集油茶象甲。利用油茶象甲成虫假死性的特征，采用振落法捕捉油茶象甲成虫。首先在进油茶树底下平铺一层白色的细纱网，然后摇晃油茶树，待油茶象甲掉落到细纱网上，将其放入养虫笼中并带回实验室。饲养条件为温度（25±1）℃、相对湿度80%左右、光周期L:D=12 h:12 h，隔天喂食洗净的油茶鲜果。

1.2 油茶象甲对油茶果实挥发物的触角电位测试

将表面洗净晾干的油茶果实（赣州油茶，果实长度3～5 cm，宽度2～4 cm）放在色谱纯的正己烷中浸泡10 min 收集油茶果实的挥发性物质，加入正十八烷作为内标，用无水硫酸钠去除多余水分后，用带过滤膜的移液器将样品转移到2 mL样品瓶内，并用氮吹仪浓缩到适合的浓度，保存在-20 ℃冰箱内待用。用GC-EAD 方法测试油茶象甲触角对油茶果实挥发物的触角电生理反应。气相色谱型号为安捷伦7890B，色谱条件为：HP-5 (30 m,0.25 mm 内径,0.25 μm 膜厚) 毛细管色谱柱，载气为高纯氮气，进样口温度250℃，检测器280℃，柱箱升温程序为40 ℃保留3 min、10 ℃/min升至250℃并保留5 min。利用荷兰Syntech 公司的EAG 昆虫触角电位记录仪测定挥发物引起昆虫的触角电生理反应大小。沿油茶象甲触角基部将触角剪下，并在触角尖部切开0.5 mm，然后将触角连接到触角电位仪的两个蘸有导电胶的电极上。GC 和EAG 的样品分流比为1:1。采用手动不分流进样模式进样1 µL，测试油茶象甲的触角电位反应。每次实验重复5 根触角以上。

1.3 活性挥发物的鉴定

用安捷伦气相质谱（GC-MS：7890B-5977B）对油茶果实中对油茶象甲具有电生理活性的挥发物进行鉴定。GC 的进样口温度、升温条件、色谱柱规格、柱流量等色谱条件和GC-EAD 实验中的相同，进样分流比为30:1。MS 条件为：传输线温度250 ℃，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，溶剂延迟3 min，离子扫描范围50～300。根据NIST17 普库中的特征离子片段对化合物进行鉴定，同时购买标准品对鉴定结果进行确认。

1.4 油茶象甲对活性挥发物的行为反应测试

利用Y 型嗅觉仪测试单头油茶象甲对鉴定的挥发物的行为反应。在实验中，分别测试雌油茶象甲对0.1、1、10 和100 ng/µL 正十八烷和油酸酰胺（溶于正己烷当中）的反应。实验过程中，在Y 型嗅觉仪的一个臂中加入蘸有活性物质的滤纸作为处理，另一臂中加入蘸有正己烷的滤纸作为对照。实验过程中保持气流流速为1.2 L/min。雌虫放入Y 型管中观察5 min，当雌虫进入Y 型管一侧超过3 cm 且停留时间超过1 min 则记为一个有效选择。实验过程中只统计有效选择的虫数。在进行5 个有效重复后，将装置拆解开用酒精进行冲洗并烘干，然后再进行重复实验，每组实验记录20 个有效重复。实验中将整个装置用不透光的黑布罩住，防止光源对实蝇的选择造成影响。

1.5 数据分析

利用SPSS (version 20) 中的卡方检验(P＜0.05) 分析Y 型嗅觉仪中处理与对照间差异。

2 结果与分析

2.1 油茶果实中对油茶象甲具有生理活性挥发物的筛选和鉴定

GC-EAD 实验结果表明，在15.05、19.30、21.97 和22.79 min 4 个出峰时间点，挥发物能够引起油茶象甲较强的触角电生理反应（图2）。因此，将这4 个物质作为备选活性物质。通过GC-MS 分析和NIST 谱库比对发现，在15.05 min 出峰时间的物质，判定为正十八烷，在19.30 min 出峰的物质判定为油酸酰胺，另外两个出峰时间的物质由于比对相似性较低，暂时无法鉴定。正十八烷和油酸酰胺标准品的GC 出峰时间分别为15.04 和19.28 min，和GC-EAD 中测试的出峰时间基本一致。通过GC-MS 质谱图比较分析，确定这两个时间出峰的物质为正十八烷和油酸酰胺（图3）。

图2 油茶果实挥发物对油茶象甲的触角GC-EAD 反应图Fig. 2 Electroantennogram of antennae of Curculio chinensis to volatiles of Camellia oleifera fruits

图3 对油茶象甲具有电生理活性的两种挥发物（a 正十八烷；b 油酸酰胺）的质谱图Fig. 3 Mass spectrograms of (a) n-Octadecane and (b) Oleamide that induce antennae response of Curculio chinensis

2.2 油茶象甲对不同浓度活性挥发物的行为选择

Y 型嗅觉仪选择实验结果表明，0.1 和1 ng/µL的正十八烷对油茶象甲具有较强的驱避作用（0.1 ng/µL:c2=9.29，P=0.007;1 ng/µL:c2=14.23，P＜0.001），但是油茶象甲对10 ng/µL 和100 ng/µL 浓度的十八烷没有显著趋性（P＞0.05,图4）。1 ng/µL的油酸酰胺对油茶象甲具有较强的吸引作用（c2=15.52，P＜0.001），其它3 个浓度多油茶象甲无显著引诱作用（P＞0.05,图4）。

图4 油茶象甲对不同浓度正十八烷和油酸酰胺的选择行为Fig. 4 Selection of Curculio chinensis to different concentration of n-Octadecane and Oleamide

3 讨论

本研究发现油茶果实中有4 种化合物能够引起油茶象甲的触角电生理反应，通过GC-MS 分析和购买标准品，确定了其中两种化合物正十八烷和油酸酰胺。本研究首次报道了油茶果实挥发物和油茶象甲选择行为之间的关系，对进一步认识油茶象甲虫对寄主进行取食产卵的行为具有重要意义。

研究结果表明，中浓度的油酸酰胺对油茶象甲产卵具有引诱效果，而在低浓度和高浓度下这种引诱效果减弱或消失，这说明油茶象甲对油酸酰胺的嗅觉反应强弱取决于化合物浓度大小。这种挥发物对昆虫行为的浓度剂量效应在其它昆虫中也有报道。例如，低浓度的β-石竹烯能够引诱斑翅果蝇（Drosophila suzukii）雌成虫进行产卵，而高浓度下则表现为产卵驱避效果，并且随着浓度升高，斑翅果蝇的产卵量逐渐降低[10]。已有研究表明许多植物的挥发物中含有油酸酰胺，例如金线兰（Anoectochilus roxburghii）、燕麦（Avena sativa）、虎舌红（Ardisia mamillata）、茭白（Zizania latifolia）等[11-14]，表明油酸酰胺是一类广泛存在植物当中的挥发物，可能对多种昆虫具有一定的生理活性。

有研究报道瓜蚜（Aphis gossypii）为害黄瓜后会诱导植株释放正十八烷[15]，被黑条矮缩病毒危害的稻株会诱导释放出正十八烷[16]。然而，这些虫害或者病害诱导释放的挥发物是否能够驱避害虫继续为害或者引诱害虫天敌，目前还不清楚。本研究中的中低浓度正十八烷对油茶象甲具有较强的驱避作用，说明正十八烷可能是植物用来防御害虫取食危害的一种手段。由于本研究中是用正己烷浸提的办法提取化合物，因此，油菜果实在虫害或机械损伤下能否诱导还不清楚。因此，在接下来的研究中，将探索更合适的方法，例如通过固相微萃取等技术，比较研究油茶在健康、虫害及机械损伤等条件下的挥发物差异。

在通过调控昆虫行为进行害虫防治的方法中有一种叫做推拉策略，“推”是指在林地或作物田内，利用行为驱避剂驱离害虫；“拉”是指在林地外缘或作物田边，利用害虫引诱剂吸引害虫，并将害虫集中消灭[17]。油茶象甲对不同浓度正十八烷和油酸酰胺表现出的驱避和引诱的不同行为反应则为利用推拉策略防治油茶象甲提供了一种新的思路，但该推拉策略还需要进一步野外实验验证。