染料木黄酮对氧化应激和缺血/再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡的保护作用及机制

张立炜 苏哲 刘大成 周长勇

(青岛大学附属医院急诊内科，山东 青岛 266003)

目前，心血管疾病(CVD)仍然是人类主要的死亡原因[1]。心肌缺血再灌注(I/R)可导致局部缺血性心肌损伤，称为心肌I/R损伤[2]，细胞凋亡是引起心肌I/R损伤的重要原因之一[3]。因此，减少心肌细胞的凋亡是治疗CVD的关键。异黄酮是一种植物雌激素，可以有效治疗CVD[4-5]。染料木黄酮(GEN)是一种大豆制品中的异黄酮，被普遍认为是蛋白酪氨酸激酶(PTK)的抑制剂[6-7]，具有显著的抗氧化、抗癌及抗衰老等作用[8-10]。目前，已有研究证明GEN具有心脏保护作用，其是通过激活Ca2+通道、Cl-通道或者通过激酶途径发挥心脏保护作用[11-12]。也有报道发现GEN同时具有缓解心肌肥大[13]、减轻心脏功能障碍[11]等心脏保护功能。此外，最近有研究证明SDF-1a/CXCR4信号通路在CVD，尤其是心脏修复和缺血后的组织稳态中起着重要作用[14-15]，但CXCR4是否影响心脏I/R仍然是未知的。本研究旨在探讨GEN是否通过调控CXCR4蛋白的表达来抑制氧化应激和I/R损伤诱导的心肌细胞凋亡，进而发挥心脏保护作用。

1 材料和方法

1.1 材料

GEN购自西安青悦生物技术有限公司。H9c2细胞由青岛大学转化医学院提供。7～8周龄雄性C57小鼠购自北京维通利华生物科技有限公司。涉及动物的所有程序均经过青岛大学医学部动物保护与采用委员会的审查和批准。

1.2 试剂与试剂盒

Dulbecco改良的Eagle培养基购自美国GIBCO公司；Bax抗体、Bcl-2抗体和CXCR4抗体均购自英国Abcam公司。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自美国YEASEN公司。

1.3 细胞培养与处理

将H9c2细胞接种于含体积分数0.1牛血清、100 kU/L青霉素与100 mg/L链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基中，细胞置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中培养。根据前期预实验结果,本实验以普通培养液(对照组)、加入100 mol/L过氧化氢(过氧化氢组)及同时加入100 mol/L过氧化氢和0.1 mol/L GEN(研究组)分别培养H9c2细胞，24 h后进行相应实验。

1.4 小鼠心肌I/R损伤模型的建立及各组的处理

将小鼠随机分为对照组、I/R损伤组(I/R组)、I/R损伤+GEN组(研究组)，每组5只小鼠。对照组行假手术处理；I/R组将小鼠心脏左前降支冠状动脉(LAD)结扎30 min后再灌注3 h；研究组小鼠预先腹膜内注射50 mg/kg的GEN后结扎LAD并再灌注3 h。随后用颈椎脱臼法处死所有小鼠，开胸取小鼠心脏，在4 ℃下置于4%多聚甲醛中固定24 h后对其行冰冻切片，用于后续实验。

1.5 TUNEL染色和测定

将细胞和组织切片分别在PBS缓冲液中洗涤，然后在4 ℃下于4%多聚甲醛中固定30 min。将固定的细胞及切片在PBS缓冲液中洗涤3次，并在室温下用通透溶液处理25 min。采用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡情况，并记录TUNEL阳性细胞的数目，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比。

1.6 免疫印迹分析

在含有体积分数0.01蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解并提取动物实验中对照组、I/R组和研究组中心肌细胞的总蛋白以及细胞实验中对照组、过氧化氢组和研究组H9c2细胞的总蛋白。每个样品中等量的蛋白质在含有体积分数0.12十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。37 ℃下将膜在封闭溶液中浸泡1 h后用Tris缓冲盐水洗涤15 min，将膜在含体积分数0.05的脱脂牛奶中封闭1 h后与相对应的一抗和二抗按序孵育。检测动物实验各组心肌细胞Bax和Bcl-2蛋白表达情况以及细胞实验中各组H9c2细胞的Bax、Bcl-2和CXCR4蛋白表达情况。

2 结 果

2.1 GEN对过氧化氢诱导的细胞凋亡以及蛋白表达的影响

TUNEL法检测结果显示，对照组、过氧化氢组以及研究组凋亡细胞数占总细胞数的百分比分别为(36.23±3.03)%、(50.34±3.34)%、(38.92±2.63)%，研究组的凋亡细胞数占总细胞数的百分比与对照组和过氧化氢治疗组相比，差异具有显著意义(F=326.53,P<0.05)。

免疫印迹实验结果显示，对照组、过氧化氢组及研究组中心肌细胞Bax蛋白表达量分别为1.57±0.50、30.75±1.70、11.00±1.82，研究组Bax蛋白表达量与对照组和过氧化氢治疗组相比，差异有统计学意义(F=14.32,P<0.05)；对照组、过氧化氢组及研究组心肌细胞Bcl-2蛋白表达量分别为0.47±0.03、0.35±0.01、0.44±0.06，研究组Bcl-2蛋白表达量与对照组和过氧化氢组相比，差异具有统计学意义(F=144.76,P<0.05)。对照组、过氧化氢组及研究组中H9c2细胞CXCR4蛋白表达量分别为0.54±0.04、0.84±0.07、0.62±0.03，研究组H9c2细胞CXCR4蛋白水平与对照组和过氧化氢组相比，差异有显著性(F=23.98,P<0.05)。

2.2 GEN对动物I/R损伤后心肌细胞凋亡的影响

TUNEL法检测结果显示，对照组、I/R组及研究组动物模型心脏中凋亡细胞数占总细胞数的百分比分别为(1.25±0.95)%、(21.50±2.65)%、(6.07±1.35)%，与I/R组相比较，研究组小鼠I/R损伤后心肌细胞凋亡数明显减少，差异具有显著意义(F=121.74,P<0.05)。免疫印迹结果显示，对照组、I/R组及研究组动物模型心脏中Bcl-2/Bax比值分别为1.23±0.07、0.42±0.03、2.03±0.08，与I/R组相比，研究组小鼠I/R损伤后心肌Bcl-2/Bax比值明显增高，差异具有显著性(F=54.16,P<0.05)。

3 讨 论

CVD分为慢性CVD和急性CVD，患者死亡率极高[1-2]。目前CVD的治疗方案多采用西药治疗，但西药治疗存在一定的副作用，致使患者依从性较差。研究表明，中药疗法是预防和治疗CVD比较有前途的综合疗法之一[16-18]。

GEN具有显著的心脏保护作用。本研究中，经GEN预处理可抑制过氧化氢诱导的Bax蛋白表达增加，同时可增加过氧化氢诱导的Bcl-2蛋白表达，TUNNEL法检测结果显示，GEN预处理可显著减少H9c2细胞的凋亡，在动物实验中，GEN预处理也可减少小鼠I/R损伤后的心肌细胞凋亡，这表明GEN预处理可明显抑制氧化应激和I/R损伤诱导的心肌细胞凋亡。另一方面，CXCR4蛋白的表达与细胞凋亡密切相关，其可促进氧化应激诱导的心肌细胞凋亡，而免疫印迹法检测结果显示，细胞实验研究组中H9c2细胞的CXCR4蛋白表达量远低于过氧化氢组细胞的CXCR4蛋白表达量，提示GEN预处理可明显抑制CXCR4蛋白的表达，进而抑制氧化应激诱导的心肌细胞凋亡。GEN于1994年首次被证明通过Ras-MAP激酶信号传导途径预防心肌细胞肥大[6]，后续研究证明它通过调节Ca2+通道、Cl-通道的活性以及心肌细胞中的心脏兴奋-收缩耦联来参与心脏代谢[11-12]。同时，GEN还可通过调节miR-451/TIMP2来逆转心脏肥大[13]。因此，GEN是一种靶向治疗CVD十分有前途的药物，可能在改善心脏功能障碍方面具有更多潜在的作用。而本研究结果显示，GEN能够通过调节CXCR4蛋白表达来抑制细胞凋亡的发生，以防止氧化应激对心脏的伤害。但是，该机制下的特定信号传导途径尚不明确。CXCR4已被证明是microRNA-210的重要靶基因，microRNA-210通过靶向CXCR4蛋白进而加重缺氧所致的心肌细胞损伤[19]。另外，GEN也参与调节心肌细胞中microRNA的表达[15,20]，其极有可能调节CXCR4上游的某些microRNA或蛋白质从而影响细胞的凋亡程序。因此，探讨GEN对CXCR4蛋白表达的调控机制具有重要的应用价值。

综上所述，GEN可能通过下调心肌细胞内的CXCR4蛋白的表达进而抑制氧化应激和I/R损伤下的心肌细胞凋亡，然而GEN调节CXCR4的机制还需要进一步研究。