11C-AZD9291分子探针检测肺癌EGFR 19del突变的实验研究*

刘佳，马进安，张锦明，赵颜忠，罗丹静，张晓军，付华平，阙凯琳，韩宸，张颖

（1.中南大学湘雅二医院 肿瘤科，湖南 长沙 410011；2.中国人民解放军301 医院 核医学科，北京 100039；3.中南大学湘雅三医院 医学实验中心，湖南 长沙 410013）

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFRTKIs）吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼及奥希替尼（AZD9291）治疗EGFR 突变的晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）疗效超越了传统化疗[1-4]。约20%肺癌患者难以获得组织学病理及突变基因检测，基于EGFR 特异性分子探针的正电子发射断层扫描（positron emission tomography,PET）可鉴定EGFR 突变。AZD9291 能与突变EGFR 特异性结合，理论上核素11C 标记的AZD9291（11C-AZD9291）可作为检测EGFR 突变的特异性分子探针[5]。本研究拟从实验动物水平验证11C-AZD9291 检测19del 突变EGFR 蛋白的可行性。

1 材料与方法

1.1 设备、试剂和动物

11C-AZD9291 通过国产PET 自动化11C 多 功能合成模块来合成，11C-CH3-Triflate 与N-去甲基AZD9291 在碱性条件下反应，经高效液相色谱法纯化和固相萃取得11C-AZD9291。孵箱购自北京傲松欣实验室设备有限公司，12 孔板购自上海拜力科技有限公司，异氟烷购自华中海威（北京）基因科技有限公司，A549、HCC827 肺腺癌细胞株购自中国科学院上海细胞库；普通昆明小鼠15 只购自中国人民解放军总医院动物中心，BALB/c 裸鼠9 只购自中国科学院动物研究所（北京），厄洛替尼标准品购自上海甄准生物科技有限公司，Explore Vista micro-PET/CT 成像及分析系统购自美国GE 公司。

1.2 普通昆明小鼠体内11C-AZD9291 的生物学 分布

普通昆明小鼠尾静脉注射300μCi 的11C-AZD9291，分别于5、15 及30 min 时处死5 只。称取小鼠血、心及肝等重量并计算出每克组织摄取11C-AZD9291 注射剂量的百分数。

1.3 荷瘤鼠micro-PET/CT 显像

取正常传代培养的人肺腺癌细胞株HCC827（EGFR 19del 突变）和A549（EGFR 野生型），常规培养后制成单细胞悬液（5×106个/ml），取0.2 ml 皮下接种于BALB/c 裸鼠上肢。接种2～4 周后将6 只肿瘤大小合适（直径5～10 mm）的HCC827 荷瘤鼠分成实验组和阻断组，每组3 只。实验组：尾静脉注射2 mCi11C-AZD9291（0.21 Ci/kg）后，异氟烷气体麻醉固定，20 min 后进行micro-PET 动物活体显像与分析。阻断组：尾静脉同时注射阻断剂厄洛替尼标准品（50 mg/kg）和2 mCi11C-AZD9291，20 min 后进行动物活体显像与分析。3 只A549 荷瘤鼠尾静脉注射2 mCi11C-AZD9291 作为对照组，同上述方法进行动物活体显像与分析。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或随机区组设计的方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 普通昆明小鼠血液及各组织器官不同时间的放射性摄取率比较

普通昆明小鼠经尾静脉注射11C-AZD9291 后，血液放射性摄取量随着时间延长迅速清除，在30 min 时下降至最低。除血液外，11C-AZD9291 在普通昆明小鼠体内的分布主要在肝、肾及肺，而骨、肌肉及脑则摄取相对较低。5、15 和30 min 时血、肝、肾、肺、心及肌肉放射性摄取率比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），5 min 较15 min 高（P＜0.05）。见表1和图1。

表1 普通昆明小鼠血液及各组织器官不同时间的放射性摄取率比较 （n =5，%，±s）

表1 普通昆明小鼠血液及各组织器官不同时间的放射性摄取率比较 （n =5，%，±s）

标本 5 min 15 min 30 min F 值 P 值血2.344±0.382 1.285±0.386 0.984±0.152 19.245 0.000心1.750±0.248 0.715±0.099 0.682±0.097 23.591 0.000 肺3.727±0.792 2.220±0.242 2.267±0.250 14.698 0.001脾1.957±0.294 1.963±0.633 2.482±0.302 2.354 0.137肝16.443±3.816 9.964±2.403 8.650±0.339 93.657 0.000肾4.845±0.775 2.207±0.168 2.075±0.208 54.513 0.000 肌肉 0.790±0.043 0.410±0.050 0.421±0.046 32.804 0.000骨0.693±0.177 0.494±0.081 0.550±0.115 3.077 0.083脑0.580±0.061 0.511±0.095 0.592±0.026 1.955 0.184

图1 普通昆明小鼠血液及各组织器官11C-AZD9291 的生物分布 （n =5）

2.2 荷瘤鼠micro-PET/CT 显像

实验组荷瘤鼠尾静脉注射11C-AZD9291 20 min 后micro-PET/CT 成像显示，接种肿瘤区存在明显放射性浓聚；对照组瘤荷鼠尾静脉注射11C-AZD9291 20 min后micro-PET/CT 成像显示接种肿瘤区仅轻度放射性浓聚。实验组荷瘤鼠标准摄取值（standard uptake value,SUV）为（5.20±0.137），对照组为（2.60±0.066），经t检验，差异有统计学意义（t=29.566，P=0.000），实验组高于对照组。见图2。

2.3 荷瘤鼠阻断后micro-PET/CT 显像

阻断组荷瘤鼠尾静脉同时注射阻断剂厄洛替尼和11C-AZD9291 20 min 后micro-PET/CT 成像显示，接种肿瘤区仅轻度放射性浓聚。实验组荷瘤鼠SUV 为（5.20±0.137），阻断组为（2.10±0.089），经t检验，差异有统计学意义（t=32.799，P=0.000），实验组高于阻断组。见图2。

图2 各组荷瘤鼠micro-PET/CT 显像

3 讨论

核医学PET 成像技术是一种非侵入性和高度敏感的检测方法，可以对体内靶向分子的表达进行定性及定量分析，研发出合适的放射性示踪剂是实施此检测技术的关键。第一、二代EGFR-TKIs 在人体内既能与敏感突变的EGFR 结合，也能与野生的EGFR 结合，以其为基础的分子探针，如11C-吉非替尼、18F-吉非替尼、11C-厄洛替尼及18F-阿法替尼等均为非特异性探针，能够检测EGFR 蛋白表达水平，但特异性识别肿瘤组织EGFR 突变的作用较差[6-13]。11C-厄洛替尼能有效地检测EGFR 突变，但也存在着本底摄取较高、正常组织显影的问题。第三代EGFR-TKIs产品AZD9291（奥希替尼）可与存在19del、L858R、T790M 等突变的EGFR 蛋白不可逆特异性结合，与突变型EGFR 的结合力是野生型的40 倍，具有较高的靶/本比。使用同位素标记AZD9291，并将其作为PET-CT 示踪剂检测肺癌组织中EGFR 突变蛋白状态是一项非常有意义的探索。

本研究结果显示，11C-AZD9291 在实验组荷瘤鼠移植瘤区呈放射性浓聚，而周围组织无或轻度摄取，对照组则显示轻度放射性浓聚，实验组SUV 高于对照组。这说明11C-AZD9291 分子探针能与19del 突变的EGFR 蛋白特异性结合。阻断组移植瘤区仅出现轻度放射性浓聚，实验组SUV 高于阻断组。这说明在裸鼠模型中11C-AZD9291 能特异性结合移植瘤中19del 突变的EGFR 蛋白，并且能被厄洛替尼阻断，证明11C-AZD9291 可用于检测体内EGFR 的19del突变状态。结合本文所做的细胞学实验结果，说明11C-AZD9291 作为载体特异性分子探针检测EGFR 蛋白19del 突变是可行的。

通过分析普通昆明小鼠血液及各器官的11C-AZD9291 的生物学分布，笔者发现11C-AZD9291 在肝脏的放射摄取值最高，并随时间推移迅速下降，说明11C-AZD9291 的代谢可能是通过肝脏的快速清除实现的，这与其他EGFR-TKIs 分子探针的代谢机制相类 似[14-16]。肝脏对11C-AZD9291 摄取率最高，其次为肾、肺，这可能是由于野生型EGFR 在正常组织中也有一定表达，也会影响11C-AZD9291 对EGFR19del 突变人肺癌的肝脏、肾脏转移灶的显影[17]。大脑的放射性摄取率较低可能与正常脑组织中EGFR 表达水平低有关[18]。

本研究仍存在不足，例如11C-AZD9291 探针不能区分EGFR 突变的类型，只能通过检测肿瘤与探针结合的能力，间接反映是否存在EGFR 突变。所用标记核素11C 的半衰期过短，不适合临床的广泛应用。本研究的动物实验证实11C-AZD9291 分子探针对存在19del 突变的EGFR 蛋白具有较好的特异性结合能力。11C-AZD9291 分子探针能否示踪存在L858R、T790M等突变的EGFR 蛋白，后续将进一步研究。