来曲唑联合高脂膳食诱导PCOS-IR大鼠模型复制时间及其内分泌、代谢改变的实验研究*

王明星，尹谦，张晓丹，许昕

（1.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；2.北京中医药大学，北京 100027）

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome, PCOS）是指青春期及育龄期妇女常见的一种复杂性生殖功能障碍及糖脂代谢异常的内分泌紊乱综合征，其生殖功能障碍包括卵泡发育和排卵异常，是青春期、育龄期妇女月经紊乱及不孕的原因之一[1]。该病在国外育龄期妇女中发病率约为20%，我国报道的PCOS发病率为5%～10%[2]。PCOS 发病的重要病理生理基础为胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）。BURGHEN于1980年首次报道PCOS 患者存在高胰岛素血症，流行病学研究证实多囊卵巢综合征胰岛素抵抗（PCOSIR）的发病率约为5%，占PCOS 的50%～70%[3]。PCOS-IR 具有高发性、异质性、终身性、难治性等特点，其病理机制较PCOS 更为复杂，除排卵障碍、高雄激素血症之外，常引起肥胖、高胰岛素血症等代谢异常，后者又加重IR，形成病理状态的恶性循环，使PCOSIR 复杂演变，最终可导致脂肪肝、糖尿病、高血压、子宫内膜癌变及代谢综合征等远期并发症。近年来，PCOS-IR 的发病率逐渐上升，其治疗相当棘手，治愈难度很大，该病损害生殖功能的同时，更影响女性身心健康。本研究复制稳定理想的PCOS-IR 大鼠模型，以研究和探索该病的发病机制及药物作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选取6 ～8 周龄，无特定病原体级SD 雌性大鼠48 只，体重160 ～180 g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（京）2018-0006。将48 只大鼠按体重排序编号，利用随机数字表法将其分为对照组和模型组，每组24 只；分别在第21、24、27 及30 天处死6 只大鼠。本实验经北京市中医研究所伦理委员会的审批（审批文号：2018050101）。

1.2 材料与试剂

羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium salt, CMC-Na）（ 购 自 美 国Sigma 公 司， 批 号：1002375619），用超纯水配制成0.5%（质量分数）CMC-Na 溶液；来曲唑（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：国药准字HI9991001），将1 mg/（kg·d）的来曲唑溶于0.5%（质量分数）CMC-Na 溶液中配制成来曲唑混悬液。罗氏活力型血糖仪试纸（德国罗氏诊断有限公司）；血清胰岛素（INS）（批号：CEA447Ra-96T）、甘油三酯（TG）（批号：CEB687Ge-96T）、促卵泡激素（FSH）（批号：CEA830Ra-96T）、黄体生成素（LH）（批号：CEA441Ra-96T）、睾酮（T）（批号：CEA458Ge-96T）试剂盒均由北京北方生物 技术研究所有限公司提供。高脂饲料（H10060，5.24 kal/kg，供能比：蛋白20%、碳水化合物20%、脂肪60%），普通饲料（H10010，3.85 kal/kg，供能比：蛋白20%、碳水化合物70%、脂肪10%），由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，主要成分为酪蛋白、糊精、蔗糖、纤维素、豆油、猪油、多矿、多维、胆碱等。

1.3 仪器与设备

超低温冰箱、组织脱水机、石蜡包埋机、石蜡切片机、图像分析系统、紫外分光光度计、高速冷冻离心机等均由北京市中医研究所实验室平台提供。

1.4 方法

1.4.1 模型复制方法 本实验参考KAFALI[4]及本课题组[5]前期来曲唑模型复制法。48 只SD 大鼠适应性喂养3 d 后，对照组大鼠用普通饲料喂养30d，模型组大鼠用高脂饲料喂养30d。喂养21d 后，对照组大鼠每天按照1 ml/100 g 灌胃CMC-Na 溶液，模型组大鼠每天按照1 ml/100 g 灌胃来曲唑混悬液，两组均在第21、24、27 及30 天处死6 只大鼠。

1.4.2 检测指标 ①大鼠体重及体长。固定每周测量大鼠体重及体长（大鼠鼻子至肛门直线距离），绘制大鼠体重增长变化曲线，并计算Lee's 指数[6]（可作为评价成年肥胖模型大鼠肥胖程度的指标）。②大鼠卵巢重量及卵巢体积。两组大鼠分别在第21、24、27 及30 天实验结束后，腹腔麻醉取出大鼠左侧卵巢，进行称重，计算卵巢指数（‰）=卵巢重量（g）/体重（g）×1 000；分别测量大鼠卵巢长、短径，计算卵巢体积[7]（mm3）=（π/6）×长径（mm）×短径（mm）2。③性激素与代谢指标。两组大鼠分别在第21、24、27 及30天灌胃后，禁食8h，次日鼠尾采血，利用罗氏活力型血糖仪试纸测定空腹血糖（FBG）并记录。随后腹腔注射质量分数为2%戊巴比妥钠（0.2ml/100g）进行麻醉，取腹主动脉血5 ～8ml，离心收集血清。严格按照ELISA 试剂盒说明书检测大鼠血清FSH、LH、T、空腹胰岛素（FINS）及TG 的水平。计算FSH/LH 比值和HOMA-IR[HOMA-IR=FPG（mmol/L）×FINS（mIU/L）/22.5]。④镜下卵巢及卵泡情况。两组大鼠分别在第21、24、27 及30 天实验结束后，腹腔麻醉取出大鼠左侧卵巢，用体积分数为4%的多聚甲醛固定卵巢组织，常规组织脱水，石蜡包埋；将卵巢组织切成5 μm 厚切片，常规脱蜡、水化后经苏木精-伊红（HE）染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察两组大鼠卵巢组织病理学变化，于低倍镜下记录每只大鼠卵巢组织中的卵泡个数。

1.5 统计学方法

数据分析采用GraphPad Prism 7 及SPSS 17.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，两两比较采用LSD-t检验，两组比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠一般情况

灌胃期间，对照组大鼠未出现任何不适症状，大鼠饮食及活动自如。模型组大鼠偶见情绪躁动，出现灌胃困难等情况，等待约10 min 后大鼠情绪可恢复平稳，继续灌胃，其饮食及活动均无异常状况；实验期间两组未见大鼠死亡。

2.2 两组大鼠体重及Lee's 指数

两组大鼠喂养第1、7 及14 天的体重及Lee's 指数比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的大鼠体重（F=45.810，P=0.000）及Lee's指数（F=8.347，P=0.008）有差异。②两组大鼠体重（F=1065.000，P=0.000）及Lee's 指数（F=14.080，P=0.000）有差异，随着喂养天数的增加，两组大鼠体重及Lee's 指数均逐渐增高；③模型组与对照组的大鼠体重（F=137.500，P=0.000）及Lee's 指数（F=24.980，P=0.000）变化趋势有差异，即喂养7d 后，模型组大鼠体重高于同时间点的对照组；喂养14d 后，模型组大鼠Lee's 指数高于同时间点的对照组。见表1。

喂养21 d 后，随着喂养时间继续延长，模型组各时间点大鼠体重及Lee's 指数均高于同时间点对照组（P＜0.05）；模型组第21、24、27 和30 天Lee's 指数比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=21.070，P=0.000），模型组第27 和30 天Lee's 指数均高于第21天（P＜0.05）。见表2、3。

2.3 两组大鼠卵巢指数及卵巢体积

喂养21 d 后，随着喂养时间的延长，对照组第21、24、27 和30 天大鼠卵巢指数比较，差异有统计学意义（F=8.641，P=0.001），而模型组差异无统计学意义（F=0.589，P=0.629）；模型组第27 和30 天大鼠卵巢指数低于同时间点对照组（P＜0.05）（见表4）。喂养21 d 后，模型组第21、24、27 和30 天大鼠的卵巢体积比较，差异有统计学意义（F=3.564，P=0.031），随着喂养时间延长呈上升趋势，第30 天大鼠的卵巢体积大于第21 和24 天（P＜0.05）。模型组各时间点大鼠卵巢体积均大于同时间点对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表5）。

表1 两组大鼠第1、7 及14 天体重及Lee's 指数比较 （n =24，±s）

表1 两组大鼠第1、7 及14 天体重及Lee's 指数比较 （n =24，±s）

注：Lee's 指数=÷体长

组别体重/g Lee's 指数第1 天 第7 天 第14 天 第1 天 第7 天 第14 天对照组 181.74±9.59 207.77±11.71 224.73±14.60 3.12±0.14 3.16±0.10 2.93±0.07模型组 183.60±9.50 229.43±9.24 271.18±13.16 3.10±0.10 3.13±0.14 3.15±0.07

表2 两组大鼠第21、24、27 及30 天的体重比较（n =6，g，±s）

表2 两组大鼠第21、24、27 及30 天的体重比较（n =6，g，±s）

组别 第21 天 第24 天 第27 天 第30 天对照组 240.67±25.82 221.00±16.16 263.65±17.70 248.90±9.43模型组 303.30±19.65 300.62±22.51 313.12±17.67 308.37±20.11 t 值 11.460 7.037 5.278 6.193 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 两组大鼠第21、24、27 及30 天的Lee's 指数比较 （n =6，±s）

表3 两组大鼠第21、24、27 及30 天的Lee's 指数比较 （n =6，±s）

注：†与第21天比较，P ＜0.05。

组别 第21 天 第24 天 第27 天 第30 天对照组 3.04±0.10 2.98±0.08 3.16±0.10 3.12±0.03模型组 3.23±0.08 3.28±0.09 3.34±0.09† 3.37±0.11†t 值 6.503 -6.103 2.797 4.268 P 值 0.000 0.000 0.021 0.002

表4 两组大鼠第21、24、27 及30 天的卵巢指数比较（n =6，‰，±s）

表4 两组大鼠第21、24、27 及30 天的卵巢指数比较（n =6，‰，±s）

组别 第21 天 第24 天 第27 天 第30 天对照组 0.22±0.03 0.22±0.05 0.29±0.04 0.31±0.03模型组 0.24±0.05 0.23±0.05 0.24±0.02 0.22±0.03 t 值 0.782 0.402 3.271 5.715 P 值 0.452 0.696 0.008 0.000

表5 两组大鼠第21、24、27 及30 天的卵巢体积比较（n =6，mm3，±s）

表5 两组大鼠第21、24、27 及30 天的卵巢体积比较（n =6，mm3，±s）

注：†与第30 天比较，P ＜0.05。

组别 第21 天 第24 天 第27 天 第30 天对照组 39.08±9.09 32.29±11.82 37.80±9.61 60.47±12.79模型组 59.13±13.49† 66.71±12.82† 73.17±17.84 83.63±19.67 t 值 3.018 4.834 4.275 2.896 P 值 0.013 0.001 0.002 0.013

2.4 两组大鼠卵巢组织形态及卵泡数目

肉眼观察：对照组大鼠卵巢颜色红润，大小正常；模型组大鼠卵巢体积增大，外观颜色苍白，卵巢表面透明囊状扩张卵泡较多且分布密集。HE 染色后：低倍镜下可见，对照组卵巢组织内不同发育阶段的卵泡及多个黄体，偶见极少量的卵泡囊状扩张；模型组卵巢结构紊乱，位于卵巢表面的囊状扩张卵泡数量较对照组增多，发育阶段的卵泡及黄体减少，而窦前卵泡和闭锁卵泡增多；高倍镜下可见，对照组大鼠卵巢组织中卵泡结构比较完整，卵泡内可见8 或9 层颗粒细胞层；模型组大鼠卵巢组织中卵泡放射冠及颗粒细胞层数减少，甚至消失。见图1。

两组大鼠各时间点的卵巢表面的囊状扩张卵泡数量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组多于对照组。模型组各时间点的卵泡数量比较，差异无统计学意义（F=1.674，P=0.212）。见表6。

图1 两组大鼠不同时间点卵巢形态学变化 （HE）

表6 两组大鼠第21、24、27 及30 天卵泡数量比较（n =6，±s）

表6 两组大鼠第21、24、27 及30 天卵泡数量比较（n =6，±s）

组别 第21 天 第24 天 第27 天 第30 天对照组 18.50±3.31 20.20±0.84 21.00±3.41 22.50±4.81模型组 46.00±7.44 44.75±4.20 42.17±7.14 35.50±7.11 t 值 7.697 11.140 6.555 4.414 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 两组大鼠各时间点的FBG、FINS、HOMA-IR水平

模型组第21、24、27 和30 天的FBG 比较，差异无统计学意义（F=2.975，P=0.055）；两组大鼠各时间点的FBG 比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（见表7）。模型组第27 和30 天大鼠的FINS 及HOMA-IR水平较同时间点对照组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；且模型组第27 天的HOMA-IR 高于第21 天，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表8、9。

表7 两组大鼠第21、24、27 及30 天FBG 水平（n =6，±s）

表7 两组大鼠第21、24、27 及30 天FBG 水平（n =6，±s）

组别 第21 天 第24 天 第27 天 第30 天对照组 5.18±0.50 5.58±0.39 5.67±0.61 5.16±0.41模型组 4.83±0.57 5.40±0.35 5.54±0.91 5.23±0.56 t 值 1.182 0.805 0.044 0.121 P 值 0.262 0.442 0.966 0.906

表8 两组大鼠第21、24、27 及30 天血清FINS 水平（n =6，±s）

表8 两组大鼠第21、24、27 及30 天血清FINS 水平（n =6，±s）

注：†与第21 天比较，P ＜0.05。

组别 第21 天 第24 天 第27 天 第30 天对照组 36.02±3.58 40.50±7.44 35.05±5.13 32.87±8.71模型组 37.71±2.72 39.00±8.38 45.00±1.90† 45.76±3.10†t 值 0.699 0.799 4.081 3.117 P 值 0.507 0.267 0.003 0.014

表9 两组大鼠第21、24、27 及30 天血清HOMA-IR 水平 （n =6，±s）

表9 两组大鼠第21、24、27 及30 天血清HOMA-IR 水平 （n =6，±s）

注：†与第21 天比较，P ＜0.05。

组别 第21 天 第24 天 第27 天 第30 天对照组 8.29±0.83 10.04±1.85 8.68±1.27 7.68±2.04模型组 8.10±0.58 9.36±2.01 11.24±0.33† 10.55±0.80†t 值 0.405 0.500 3.882 2.629 P 值 0.699 0.635 0.005 0.034

2.6 两组大鼠各时间点的TG 水平

两组大鼠各时间点TG 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组高于同时间点对照组；模型组第21、24、27 和30 天TG 水平比较，经单因素方差分析，差异无统计学意义（F=0.037，P=0.990）。见表10。

2.7 两组大鼠各时间点血清性激素水平

两组大鼠各时间点FSH 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组均低于同时间点对照组；模型组第21、24、27 及30 天FSH 水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=6.605，P=0.002），第24 天模型组大鼠FSH 水平低于第21 天（P＜0.05）（见表11）。两组大鼠各时间点LH 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组均高于同时间点对照组；模型组第21、24、27 及30 天LH 水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=11.940，P=0.000），模型组第21 天LH 水平高于其他时间点（P＜0.05）（见表12）。两组大鼠各时间点FSH/LH 比值比较，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组均高于同时间点对照组；模型组第21、24、27 及30 天FSH/LH比值比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=15.980，P=0.000），模型组第21 天 FSH/LH 比值高于其他时间点（P＜0.05）（见表13）。两组大鼠各时间点T 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组均高于同时间点对照组；模型组第21、24、27 及30天T 水平比较，经单因素方差分析，差异无统计学意义（F=0.572，P=0.640）（见表14）。

表10 两组大鼠第21、24、27 及30 天血清TG 水平（n =6，±s）

表10 两组大鼠第21、24、27 及30 天血清TG 水平（n =6，±s）

组别 第21 天 第24 天 第27 天 第30 天对照组 517.69±48.47 530.65±99.95 539.86±40.69 459.47±95.18模型组661.63±130.59 666.17±73.40 682.01±99.22 668.87±98.74 t 值 2.531 3.665 2.662 3.330 P 值 0.029 0.011 0.032 0.010

表11 两组大鼠第21、24、27 及30 天血清FSH 水平（n =6，±s）

表11 两组大鼠第21、24、27 及30 天血清FSH 水平（n =6，±s）

注：†与第21 天比较，P ＜0.05。

组别 第21 天 第24 天 第27 天 第30 天对照组 7.11±2.15 6.57±0.41 7.49±0.85 6.38±1.59模型组 5.84±0.57 4.67±0.59† 5.32±0.72† 4.58±0.47†t 值 1.403 5.576 4.743 3.066 P 值 0.191 0.000 0.001 0.010

表12 两组大鼠第21、24、27 及30 天血清LH 水平（n =6，±s）

表12 两组大鼠第21、24、27 及30 天血清LH 水平（n =6，±s）

注：†与第21 天比较，P ＜0.05。

组别 第21 天 第24 天 第27 天 第30 天对照组 5.91±0.80 5.69±0.55 6.08±0.49 5.77±0.49模型组 13.53±2.62 8.93±1.28† 8.73±2.59† 7.25±0.65†t 值 5.539 4.678 2.466 4.541 P 值 0.000 0.002 0.033 0.001

表13 两组大鼠第21、24、27 及30 天血清FSH/LH 比值（n =6，±s）

表13 两组大鼠第21、24、27 及30 天血清FSH/LH 比值（n =6，±s）

注：†与第21 天比较，P ＜0.05。

组别 第21 天 第24 天 第27 天 第30 天对照组 0.91±0.32 0.87±0.05 0.82±0.11 0.94±0.19模型组 2.34±0.23 1.94±0.25† 1.66±0.21† 1.59±0.18†t 值 8.842 8.434 8.730 6.521 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

表14 两组大鼠第21、24、27 及30 天血清T 水平（n =6，±s）

表14 两组大鼠第21、24、27 及30 天血清T 水平（n =6，±s）

组别 第21 天 第24 天 第27 天 第30 天对照组 4.38±0.51 4.44±1.46 5.56±1.60 4.17±1.49模型组 8.77±1.24 10.28±1.72 9.18±2.77 9.41±1.44 t 值 6.562 4.899 2.768 6.248 P 值 0.000 0.003 0.019 0.000

3 讨论

目前已有多种PCOS-IR 模型复制方法，但是国内外迄今尚无一种令人信服、可以复制PCOS-IR 病理特征的方法，缺乏动物模型复制成功的标准。脱氢表雄酮皮下注射模型复制法[8]其大鼠模型虽然具有PCOSIR 病理及内分泌特征，但持续外源性注射雄激素与PCOS-IR 模型大鼠自身体内高雄激素水平的来源不易区别，不适于研究模型大鼠雄激素的变化。丙酸睾丸酮联合高脂饲料模型复制法[8]，本研究前期复制模型时发现，模型组大鼠卵巢体积变小，镜下无明显多囊样改变，推测外源性雄激素可能抑制卵巢功能。来曲唑配合高脂膳食法诱导PCOS-IR 大鼠模型[9]，本研究前期复制模型成功[5]，结果显示模型组大鼠体重增加，镜下可见卵巢组织多囊样改变，血清FSH/LH 比值及T 水平升高，血清FINS、TG 水平及HOMA-IR 亦升高，基本符合PCOS-IR 病理及内分泌、代谢紊乱的疾病特征。有文献报道[4]来曲唑联合高脂饲料喂养21 d 可成功复制PCOS-IR 大鼠模型。亦有学者[10]将模型复制时间比较，用科学方法确定模型复制时间更加合理、更加稳定，而且便于研究的PCOS-IR 大鼠模型，结果发现，模型复制时间延长至30 d 的PCOS-IR 大鼠模型更加稳定理想；模型复制27 与30 d 的内分泌与代谢改变无差异。

来曲唑是一种芳香化酶抑制剂，而芳香化酶是雄激素向雌激素转化过程中起关键作用的限速酶[11]，一旦卵巢内的芳香化酶活性降低则可引起局部雄激素水平升高，因此，来曲唑可以阻止卵巢内雄激素向雌激素的转换，形成高雄激素血症，进而发展为多囊卵巢[12]。有文献报道高脂饲料可诱导下丘脑炎症反应，而下丘脑炎症因子的高表达可以导致胰岛素和瘦素抵抗，进一步引起机体摄食紊乱和肥胖[13]。肥胖被越来越多的学者认为是一种低度慢性炎症状态，长期处于此状态下可导致外周胰岛素抵抗，从而引起糖脂代谢紊乱[14]。有研究证实，高胰岛素血症能刺激卵巢合成大量雄激素形成高雄激素血症，尤其是游离雄激素水平升高，引起IR 的发生[15]。两者互相促进并形成IR-高胰岛素血症-高雄激素血症的恶性循环，共同参与卵巢功能障碍的发生。因此，来曲唑联合高脂膳食可以诱导出PCOSIR 动物模型。

本研究复制一种稳定理想的PCOS-IR 动物模型用于基础实验，研究结果表明，来曲唑联合高脂饲料分别喂养第21、24、27 及30 天后，模型组大鼠体重及Lee's 指数均高于同期对照组。肉眼可见模型组各时间点大鼠卵巢体积增大，卵巢表面可见较多且密集的透明囊状扩张卵泡，镜下观察卵巢呈多囊样改变，模型组大鼠卵巢囊性卵泡个数多于同期对照组。模型组大鼠血清TG 水平、FSH/LH 比值及T 水平均升高，但血清FINS 及HOMA-IR 水平直至模型复制第27 及30 天才升高，符合PCOS-IR 病程长久、病情复杂的病理特征及内分泌、代谢紊乱状态。

来曲唑联合高脂膳食连续喂养27 天，可成功复制符合PCOS-IR 患者病理特征及内分泌、代谢紊乱的大鼠模型，为后续研究奠定基础。

致谢：感谢本人的导师许昕教授长期以来给予悉心指导、深切关怀和鼎力帮助；感谢北京市中医研究所提供实验室平台及对本实验部分的支持和指导。