乙型肝炎患者胎盘组织中GSK-3β表达与HBV母婴传播的关系

宋文婷

（中国医科大学附属盛京医院，辽宁 沈阳 110001）

我国是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）携带者的高发国家，其中母婴传播是慢性HBV 感染的主要原因，约占30%[1]。约90%围生期感染HBV 者及约30%婴幼儿时期HBV 感染者可发展成慢性感染，最终可进展为肝硬化、肝癌，严重影响儿童正常生长发育及威胁生命健康[2]。近几年来临床采取联合注射乙型肝炎（以下简称乙肝）免疫球蛋白及乙肝疫苗的方法在阻断HBV 母婴传播方面获得较大成功，但仍有近20%左右的婴儿因出生时已宫内感染HBV 而导致免疫失败[3]。有研究显示[4]，胎盘组织感染和宫内感染关系密切。HBV 可通过感染胎盘滋养层细胞而逐步渗透，最终感染胎儿。糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）在调节细胞周期、细胞凋亡及炎症反应中具有重要作用，其作为磷脂酰肌醇3-激酶/（丝氨酸/苏氨酸）（PI3K/Akt）信号通路的下游蛋白，可通过正、负反馈调节控制PI3K/Akt 生物活性，有研究表明[5]，乙肝病毒X 蛋白高表达可通过调控GSK-3β 表达而促进肝癌细胞的迁移。但目前关于胎盘组织中GSK-3β 表达与母婴传播关系的报道尚少，本研究检测乙肝孕妇与正常孕妇胎盘组织中GSK-3β 表达情况，并分析其与HBV 母婴传播的关系，为临床预防提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年4月—2018年1月在中国医科大学附属盛京医院定期产检及分娩的乙肝孕妇189 例（研究组），另选取正常孕妇106 例（对照组）。其中研究组年龄23 ～37 岁，平均（29.45±3.17）岁；孕32 ～40 周，平均（36.87±2.11）周；单胎。对照组年龄22 ～38 岁，平均（29.39±3.21）岁；孕30 ～41 周，平均（36.94±2.25）周；单胎。两组年龄及孕周比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。纳入标准：①研究组符合乙肝诊断标准[6]，孕期无抗病毒治疗史。对照组正常妊娠；②两组孕妇孕周＞28 周，且孕28 周前经B超检查胎儿发育正常；③配偶为非乙肝；④均签署知情同意书。排除标准：①血清甲、丙、戊型等肝炎病毒及人类免疫缺陷病毒阳性者；②伴有梅毒、单纯疱疹病毒感染阳性者；③伴有脂肪肝、药物性肝炎、免疫性肝炎者；④有先兆流产史者；⑤伴有妊娠期糖尿病、高血压、肾病等其他内科疾病者。研究获本院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 实验试剂及仪器 HBV-DNA 定量检测试剂盒购自上海申友生物技术有限公司，GSK-3β 兔抗人多克隆抗体购自美国Cell Signaling 公司，羊抗兔二抗抗体及DAB 显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，显微镜购自北京上光仪器有限公司。

1.2.2 外周血HBV-DNA 定量检测 产前抽取研究组孕妇肘静脉血5 ml，离心分离血清，采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）对HBV-DNA 进行检测，严格按照试剂盒说明书步骤进行操作。

1.2.3 胎 盘 组 织GSK-3β 表 达 检 测 于 孕 妇胎盘娩出后30 min 内留取全层胎盘组织大小约1.0 cm×1.0 cm×1.5 cm，置入10%甲醛溶液中浸泡固定后石蜡包埋，并4 μm 切片备用，采用免疫组织化学染色检测胎盘组织GSK-3β 表达情况；另通过摄像机将所测目标的各种信息转换成数字图像，并传递至计算机系统（全自动彩色图像分析系统），标定组织片的空白处射光的吸光度值，在监视器上使用不同的分割方法及编辑功能计算GSK-3β 阳性细胞平均吸光度值（每张切片观察10 个视野）。

1.2.4 新生儿血清乙肝5 项（乙肝两对半）检测 于新生儿出生后24 h 内采集股静脉血4 ml，离心分离血清，采用酶联免疫吸附试验检测血清乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙肝病毒表面抗体（HBsAb）、乙肝病毒e 抗原（HBeAg）、乙肝病毒e 抗体（HBeAb）、乙肝病毒核心抗体（HBcAb）表达情况，试剂盒购自广东中山生物有限公司，结果运用阳性（+）、阴性（-）表示；此外，并采用qRT-PCR 法对HBV-DNA 进行检测（试剂盒及操作步骤同上）。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 研究组与对照组胎盘组织GSK-3β 表达及吸光度值 胎盘组织中以细胞核或胞内有棕黄色颗粒定为GSK-3β 阳性表达，将＜10%细胞核或胞内染色归入为阴性（-），≥10%细胞核或胞内染色归入为阳性（+），并分析GSK-3β 吸光度值。

1.3.2 研究组不同HBV-DNA 滴度胎盘组织GSK-3β 表达及吸光度值 将HBV-DNA 滴度分为＞1×102copy/ml 与≤1×102copy/ml 两类，比较胎盘组织GSK-3β 表达及吸光度值。

1.3.3 研究组新生儿HBV 感染发生情况 新生儿外周血HBsAg 阳性和/或HBV-DNA 阳性定为HBV 感染存在，并根据感染情况将研究组所有新生儿分为感染组与未感染组，检测感染组与未感染组母体胎盘组织GSK-3β 表达及吸光度值。

1.3.4 胎盘组织GSK-3β 表达与研究组新生儿HBV感染的关系 采用Logistic 多元逐步回归模型进行分析，将孕妇年龄、血清HBV-DNA 载量、血清HBeAg表达及胎盘组织GSK-3β 表达设为自变量，其中孕妇年龄＜35 岁、血清HBV-DNA 载量≤1×102copy/ml、血清HBeAg 阴性及胎盘组织GSK-3β 阴性表达均赋值为0，将孕妇年龄≥35 岁、血清HBV-DNA 载量＞1×102copy/ml、孕妇血清HBeAg 阳性及胎盘组织GSK-3β 阳性表达均赋值为1；另将新生儿HBV 感染设为因变量，未发生感染赋值为0，发生感染赋值为1，进行多因素分析。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验，采用Logistic多元逐步回归模型分析胎盘组织GSK-3β 表达与新生儿HBV 感染的关系，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组胎盘组织GSK-3β 阳性表达及吸光度值比较

研究组胎盘组织中GSK-3β 阳性表达及GSK-3β 吸光度值与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），研究组高于对照组。见表1。

2.2 研究组不同HBV-DNA 滴度胎盘组织GSK-3β 阳性表达及吸光度值比较

HBV-DNA 滴度＞1×102copy/ml 孕妇胎盘组织中GSK-3β 阳性表达及GSK-3β 吸光度值与HBV-DNA滴度≤1×102copy/ml 孕妇比较，差异有统计学意义（P＜0.05），HBV-DNA 滴度＞1×102copy/ml 孕妇高于HBVDNA ≤1×102copy/ml 孕妇。见表2。

2.3 研究组新生儿HBV 感染发生情况

研究组189 例新生儿中有19 例发生HBV 感染，新生儿HBV 感染率为10.05%（19/189），余170 例新生儿未发生HBV 感染。

表1 两组胎盘组织GSK-3β 阳性表达及吸光度值比较

2.4 感染组与未感染组母体胎盘组织GSK-3β阳性表达及吸光度值比较

感染组母体胎盘组织中GSK-3β 阳性表达及GSK-3β 吸光度值与未感染组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），感染组高于未感染组。见表3。

表2 研究组不同HBV-DNA 滴度胎盘组织GSK-3β 阳性表达及吸光度值比较

2.5 胎盘组织GSK-3β 表达与新生儿HBV 感染的关系

经Logistic 多元逐步回归模型分析，乙肝孕妇血清HBV-DNA 载 量＞1×102copy/ml、血 清HBeAg 阳性及胎盘组织GSK-3β 阳性表达均为新生儿HBV 感染的危险因素（=1.956、1.978 和1.931，P＜0.05）。见表4。

表3 感染组与未感染组母体胎盘组织GSK-3β 阳性表达及吸光度值比较

表4 新生儿HBV 感染影响因素的Logistic 回归分析参数

3 讨论

孕龄妇女HBV 感染率同一般人群相当，孕妇感染HBV 后可将HBV 传播给胎儿，严重影响婴儿健康[7]。宫内感染是HBV 母婴传播的重要途径，其主要通过胎盘组织感染胎儿。在妊娠早期，母体抵抗力相对较强，HBV 很少通过胎盘组织感染胎儿，而妊娠晚期随着胎盘面积的增大，胎盘的通透性渐渐增强，则胎儿HBV感染概率增加[8]。因此，需积极寻求有效控制HBV 宫内感染的方法。

本研究结果发现，研究组胎盘组织中GSK-3β阳性表达及GSK-3β 吸光度值较对照组高，HBVDNA 滴度＞1×102copy/ml 孕妇胎盘组织GSK-3β 阳性表达及GSK-3β 吸光度值较HBV-DNA 滴度≤1×102copy/ml孕妇高，提示乙肝患者胎盘组织中GSK-3β表达升高，且随着血清HBV-DNA 滴度的升高，GSK-3β 表达呈升高趋势。GSK-3β 普遍存在于真核生物中，属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，具有调节物质代谢及细胞生长的作用，其位于经典PI3K/Akt 信号通路的下游[9]。有研究显示[10]，HBV X 蛋白可促进肝细胞株L02 细胞中GSK-3β 活性升高。另有研究显示[11]，HBV 感染胎盘组织中GSK-3β 阳性表达高于正常胎盘组织，与本研究结果相符。另有相关研究显示[12-13]，HBsAg 可通过多种方式激活PI3K/Akt 信号通路，且GSK-3β 在HBV 感染胎盘细胞中高度活化。孕晚期胎盘的通透性增强，HBV 较易通过胎盘，胎盘组织中HBsAg 呈现阳性，因HBsAg 可上调GSK-3β 活性，且促进GSK-3β 表达，则乙肝孕妇晚期胎盘组织中GSK-3β 表达较正常妊娠者升高[14]；另HBV-DNA 滴度越高，HBV 复制越活跃，则胎盘组织中HBsAg 活性越强，促使GSK-3β 表达升高[15]。

本研究结果发现，研究组189 例新生儿中有19例发生HBV 感染，新生儿HBV 感染率为10.05%，提示乙肝孕妇发生新生儿HBV 感染的概率较高，临床医疗人员需加大重视，积极给予有效预防措施。另本研究结果还发现，感染组胎盘组织中GSK-3β 阳性表达率及GSK-3β 吸光度值较未感染组高，且经Logistic 多元逐步回归模型分析，乙肝孕妇胎盘血清HBV-DNA 载 量＞1×102copy/ml、血 清HBeAg 阳 性及胎盘组织GSK-3β 阳性表达均是新生儿HBV 感染的危险因素，提示乙肝孕妇血清HBV-DNA 高载量、HBeAg 阳性及胎盘组织GSK-3β 阳性表达均可增加新生儿HBV 感染发生风险。母亲HBV 感染标志物HBeAg 及HBV-DNA 反应病毒高度复制，其与外周血病毒量呈正相关，因绒毛膜间隙充满母体血液，则母体血中HBV 病毒可直接接触胎盘细胞，增加宫内感染发生概率。有研究报道[16]，HBV 感染孕妇胎盘的合体滋养层细胞结节增多，并具有绒毛水肿、血管充血扩张、纤维素样坏死灶增加等病理改变。另有研究显示[17]，HBV 感染胎盘后，胎盘滋养层细胞凋亡可能是阻止HBV 感染宫内胎儿的保护性机制。GSK-3β 可通过自分泌旁分泌环而激活PI3K/Akt 通路，进而促进滋养细胞增殖及抑制凋亡[18]。根据上述研究分析，HBV 感染孕妇胎盘组织GSK-3β 高表达，对滋养层细胞凋亡的抑制作用增强，则滋养细胞凋亡减少，为HBV 复制及增殖提供场所，导致宫内感染的发生，增加新生儿HBV 感染风险[19-20]。

综上所述，乙肝患者胎盘组织GSK-3β 表达升高，且孕妇外周血HBV-DNA 滴度越高，GSK-3β 活性越强，GSK-3β 高表达可提高HBV 母婴传播概率，临床工作中可将GSK-3β 作为治疗HBV 宫内感染的潜在靶点，是否可在不影响胎儿发育的前提下通过降低GSK-3β 活性而阻断HBV 垂直传播具有研究价值。