节律基因clif单核苷酸多态性与老年急性心肌梗死患者的相关性研究

吕炜俊，王云乡，应婕

（永康市第一人民医院 心内科，浙江 永康 321300）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，多表现为胸骨后疼痛，可并发心律失常、休克等，常危及生命[1]。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）是指单个核苷酸变异所导致DNA序列多态性，有研究表明AMI 与易感基因SNP 密切相关[2-3]。许多心血管疾病的发作一般都会发生在某一特定时间段，比如AMI 多半在早晨突发，呈现较明显的生物节律性。节律基因包括clock、period 和clif等，相关研究表明心血管疾病发生可能与节律基因突变或表达异常存在关联[4]。绝大多数AMI 发生是由于冠状动脉粥样硬化斑块破裂或内皮损伤，凝血系统被激活，促使血栓形成，血管内皮损伤在AMI 发生过程中发挥重要作用。凝血酶调节蛋白（Thrombomodulin, TM）是一种具有清除凝血酶、活化抗凝因子的糖蛋白，可在抗凝因子蛋白C 协同作用下减少血栓的形成，是血管内皮细胞活化标志物，是反映血管内皮损伤的较敏感指标之一[5]。纤溶酶原激活抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1）是一种与血浆波基结合素结合形成稳定复合物发挥活性的单链糖蛋白，可降低凝血及血栓形成[6]。为进一步明确节律基因在AMI 中发挥的作用及机制，本研究以老年AMI 患者为研究对象，以探讨节律基因clif 单核苷酸多态性与该病的相关性，clif 与PAI-1、TM等钟控基因的关系，为临床防治AMI 及寻找新的早期预警指标提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2016年7月—2018年3月永康市第一人民医院收治的、符合《急性心肌梗死诊断和治疗指南》[7]、《2016年中国成人血脂异常防治指南》等[8]标准的126 例老年AMI 患者作为病例组。纳入标准：意识清晰，无精神病史；无严重瓣膜病或心房颤动等；无严重凝血功能障碍或肝肾疾病；无脑梗死或恶性肿瘤者；依从性良好者等。排除标准：恶性肿瘤者；脑梗死者；心房颤动者；严重肝肾疾病者；周围动脉栓塞者；依从性差者等。同期选取132 例健康体检者作为对照组。研究经本院医学伦理委员会审查通过。所有研究对象均知情同意，并签署知情同意书。

1.2 动物及试剂

C57BL/6J 小鼠（由南京大学模式动物研究所提供），clif 基因慢病毒干扰试剂盒（中国上海吉玛公司），Trizol 试剂盒（美国Invitrogen 公司），SNaP shot 试剂盒（美国ABI 公司），血浆PAI-1 和TM 酶联免疫吸附试验试剂盒（美国Sigma 公司），DNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（qRTPCR）试剂盒（日本TaKaRa 公司），PCR 扩增引物[生工生物工程（上海）股份有限公司设计、合成]，荧光定量PCR 仪（美国罗氏公司）、电泳仪及凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司），Nano Drop 2000c 紫外分光光度计（美国Thermo Scientific 公司）。

1.3 实验方法

所有研究对象空腹采外周血5 ml，利用酚-氯仿有机油提法提取外周血细胞DNA，根据NCBI PubMed等筛选节律基因clif 位点，选择标准为人群（汉族）具有较高频率（MAF ≥0.05）、各位点间连锁平衡r2≥0.8，再结合文献，最终挑选rs2583913 和rs1071592 2 个位点。采用单碱基引物延伸法（SNaP shot 法）检测多态性位点rs2583913 和rs1071592 在病例组和对照组中的SNP 基因型和等位基因频率分布。

C57BL/6J 小鼠慢病毒转染制备过程大致如下：构建clif 基因慢病毒干扰质粒，慢病毒组转染间充质干细胞后，输注到C57BL/6J 小鼠体内，作为慢病毒转染组。慢病毒对照组的制备方法同慢病毒转染组，输注空白质粒。空白对照组输注生理盐水。每组15 只C57BL/6J 小 鼠 采 用qRT-PCR 检 测 其PAI-1 及TM mRNA 的表达水平；运用ELISA 检测干扰前后小鼠血浆中PAI-1、TM 及clif 表达量的变化。基因引物序列见表1。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较采用χ2检验；采用Hardy-Weinberg 平衡检验计算基因频率分布差异程度；采用基因计数法分析基因频率及基因型分布频率。P＜0.05 为差异有统计学意义。

表1 基因引物序列

2 结果

2.1 两组研究对象的基线资料比较

两组研究对象的性别、吸烟史、饮酒史、糖尿病史、高血压史、年龄、收缩压、血小板、甘油三酯、高密度脂蛋白及总胆固醇比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组舒张压、心率、白细胞计数、低密度脂蛋白、空腹血糖及肌钙蛋白比较，差异有统计学意义（P＜0.05），病例组高于对照组。见表2。

2.2 两组clif 基因多态性位点基因型及等位基因频率分布情况

经Hardy-Weinberg 平衡检验，发现各基因型分布频率达到遗传平衡（P＞0.05）；两组rs2583913 基因型及等位基因频率分布情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；两组rs1071592 基因型及等位基因频率分布情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.3 慢病毒干扰沉默clif 后，小鼠血浆clif、PAI-1和TM mRNA 表达情况

慢病毒转染组均转染成功。以空白对照组小鼠clif、PAI-1 及TM mRNA 表达量为1.0 作为参照，慢病毒对照组小鼠clif、PAI-1 及TM mRNA 相对表达量分别为（0.9±0.1）、（0.9±0.1）及（0.9±0.1），差异无统计学意义（P＞0.05）；慢病毒转染组小鼠clif、PAI-1 及TM mRNA 相对表达量分别为（0.2±0.1）、（0.4±0.2）及（0.6±0.1），均低于空白对照组及慢病毒对照组（P＜0.05）。见图1。

表2 两组患者的基线资料比较

表3 两组clif 基因各位点基因型及等位基因频率分布情况 例（%）

2.4 慢病毒干扰沉默clif 后，小鼠血浆中TM 和PAI-1 蛋白水平表达

各组小鼠血浆TM 和PAI-1 蛋白表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；慢病毒对照组和空白对照组血浆中TM 和PAI-1 蛋白表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；慢病毒转染组血浆TM、PAI-1 蛋白表达量均低于空白对照组及慢病毒对照组（P＜0.05）。见表4。

表4 各组小鼠血浆TM 和PAI-1 蛋白表达量比较（n =15，±s）

表4 各组小鼠血浆TM 和PAI-1 蛋白表达量比较（n =15，±s）

注：†与空白对照组或慢病毒对照组比较，P ＜0.05。

组别 TM PAI-1空白对照组 49.2±12.3 22.6±5.1慢病毒对照组 47.6±11.5 21.8±4.8慢病毒转染组 39.2±7.4† 17.6±3.3†F 值 3.838 5.415 P 值 0.029 0.008

3 讨论

AMI 是由于冠状动脉内血栓形成而引起，导致凝血及纤溶系统功能紊乱，及时抗凝治疗可以有效减少心肌坏死面积，改善预后[9]。时间生物学研究发现，AMI大部分发生于早晨，中枢生物节律以及外周生物钟紊乱，会增加心血管疾病的发生，节律基因与AMI 发病密切相关[10-11]。在大多数心血管疾病的病理过程中，存在有生物节律基因和相应的钟控基因的异常表达，而该基因在疾病的病理过程中发挥各自的作用[12-14]。一般情况下，近日节律基因变化情况可以反映心血管系统是否正常。

本研究发现，病例组与对照组clif rs1071592 位点基因型及等位基因频率分布情况均有差异，rs2583913位点基因型及等位基因频率分布情况均无差异。表明clif 基因多态性位点rs1071592 与AMI 存在一定相关性。TM 与PAI-1 在机体凝血及血栓形成中扮演重要角色，当TM与PAI-1基因表达异常时，机体血凝及抗血栓功能均将失调。相关研究发现，TM及PAI-1基因表达下调，机体血凝及抗血栓功能减弱，易导致血管中形成血栓[15]。PAI-1作为钟控基因产物之一，正常情况下表现出近日节律。相关研究表明，clock突变小鼠的纤溶活性较低，且PAI-1无近日节律[16]。表明，clock基因通过调控PAI-1来影响机体纤溶系统，进而对凝血系统产生影响。为此，本研究基于上述结论，推测clif 对PAI-1可能存在类似的调控机制。为进一步验证这一推测，本研究结果发现，慢病毒转染组clif、PAI-1 及TM mRNA 表达水平均低于空白对照组及慢病毒对照组。另外，慢病毒转染组血浆TM、PAI-1 蛋白表达水平均低于空白对照组及慢病毒对照组。表明clif 基因变异可导致TM、PAI-1等钟控基因的节律消失，易导致血管中血栓的形成。

综上所述，节律基因clif 单核苷酸多态性位点rs1071592 与老年AMI 患者存在相关性。节律基因clif 表达可降低慢病毒干扰小鼠的PAI-1 及TM 表达水平，增加血栓形成风险。本研究为节律基因在AMI中的作用及机制提供重要实验依据。