两株乳酸菌对高脂模型大鼠的益生作用

朱婕旭，高利娥，黄文康，李文苑，马 莹，郭旭生，丁梓桐

（兰州大学生命科学学院，益生菌与生物饲料研究中心，甘肃 兰州 730000）

胆固醇广泛存在于动物体的细胞膜中，是细胞膜的重要组成部分，在动物体内发挥重要的生理功能。近年来，国内外心脑血管疾病如冠心病、动脉粥样硬化等疾病的发生率和死亡率一直呈上升趋势，严重威胁着人类的健康。而血清胆固醇的升高是导致心脑血管疾病的主要风险之一[1]。有研究表明，血清胆固醇浓度每降低1%，相应心血管疾病的发病率就大约降低2%～3%[2]。目前缓解高胆固醇的方法主要有两种，一种是饮食干预，主要是限制高脂类及高胆固醇类食物的摄入，尽管这种方法有一定的效果，但是需要长期控制，因此在生活中很难达到预期效果；另一种是服用他汀类药物抑制胆固醇的合成，但是，他汀类药物具有一定的副作用[3-5]，容易诱发肝脏转氨酶活力升高和骨骼肌毒性作用[6]，有些还可引起肝功能损伤[7]。因此，针对这两种方法的缺陷，找到一种对人类安全有效的降胆固醇方法尤为重要。

2001年，联合国粮食及农业组织和世界卫生组织定义益生菌为所摄取的足够数量、对食用者身体健康能发挥有益作用的活的微生物[8]。益生菌不仅可以在肠道内起激活免疫、抗感染、调节肠道菌群平衡的作用[9-11]，还具有抗过敏[12]、抗肿瘤[13]、抗辐射延缓衰老[14]、治疗炎症性肠病[15]和改善酒精性肝损伤[16]等多种益生功能。据报道，长期食用具有降胆固醇作用的益生菌及其制品可降低血清中胆固醇及低密度脂蛋白的含量，从而降低心脑血管疾病的发病率[17]。20世纪初期，著名的生物学家梅契尼柯夫发表了《长寿学说》，首次从科学的角度揭示了乳酸菌的保健和医疗价值[18]。已有相关研究表明，乳酸菌能够有效降低小鼠和猪血清中的胆固醇、甘油三酯（triglyceride，TG）和低密度脂蛋白胆固醇（low-density liptein cholesterol，LDL-C）的含量[19-20]。其机理可能是乳酸菌通过产生胆盐水解酶与胆汁酸发生共沉淀作用降低胆固醇含量[1]。

因此，开发更多具有降胆固醇功能的乳酸菌将会为降血脂益生菌的研究与应用奠定重要的基础。本实验将罗伊氏乳杆菌BX56及瑞士乳杆菌BX-1应用到高脂模型SD大鼠中，研究其对实验动物血脂水平的影响。这两株菌是本实验室筛选自青藏高原传统发酵牦牛酸奶中体外降胆固醇能力较高的乳酸菌，具有较强的耐酸、耐胆盐以及较强的肠道黏附能力，而且用钙圈法测定发现菌株BX-1产胆盐水解酶，而菌株BX56不产胆盐水解酶，但这只是对乳酸菌降解胆固醇机理的一个初步的探讨，并未深入研究。因此，初步确定这两株菌是具有良好耐受力的降胆固醇乳酸菌。本实验进一步研究其对饲喂高脂日粮SD大鼠血脂的调节作用，旨在为降血脂益生菌的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

健康雄性SD大鼠（许可证号：LZ170423），5 周龄，体质量（150.51f 4.02）g，购自于兰州大学医学院实验动物中心，喂养于单独隔离的鼠笼。饲养条件：环境温度维持在（22f 2）℃，相对湿度维持在（55f 5）%，严格按照12 h光照和12 h黑暗循环，大鼠自由采食和饮水，并定期更换饮水和垫料。

普通饲料（粗蛋白质23%（质量分数，下同）、粗脂肪4.8%、粗纤维3.6%、钙1.1%、总磷0.7%、无氮浸出物66.8%）、高脂饲料（麦芽糖糊精7.87%、纤维素5.54%、大豆油2.77%、可可油17.19%、胆酸钠0.30%、L-胱氨酸0.33%、酪蛋白22.18%、玉米淀粉23.70%、复合矿物质4.99%、复合维生素1.11%、酒石酸胆碱0.22%、蔗糖12.53%、胆固醇1.25%[21]） 北京科奥协力有限责任公司。

总胆固醇（total cholesterol，TC）试剂盒、TG试剂盒、总胆汁酸（total bile acid，TBA）试剂盒 浙江东欧诊断产品有限公司；血清高密度脂蛋白胆固醇（highdensity liptein cholesterol，HDL-C）试剂盒、血清LDL-C试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

大鼠固定器 上海茂生生物科技发展有限公司；大鼠灌胃针 北京合力科创科技发展有限公司；U-2910紫外-可见分光光度计 日本日立公司；HZQ-F160A高低温恒温振荡培养箱 上海恒科仪器有限公司；高速冷冻离心机 美国Beckman公司；匀浆机 南通市卫宁实验器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化与菌悬液制备

将筛选得到的罗伊氏乳杆菌BX56与瑞士乳杆菌BX-1活化3 次后，分别接种于MRS液体培养基中置于37 ℃恒温培养箱培养18 h后调整菌液浓度为1h 1010CFU/mL，各吸取菌液10 mL，8 000 r/min离心2 min后弃上清液，之后用灭菌的生理盐水冲洗菌泥两次，加入10 mL生理盐水混匀，使菌液浓度仍为1h 1010CFU/mL。

1.3.2 实验分组及饲喂方式

大鼠适应性喂养一周之后称量其体质量，随机分为4 组，每组10 只。BX56组和BX-1组每天每只大鼠分别灌胃罗伊氏乳杆菌BX56（BX56组）与瑞士乳杆菌BX-1（BX-1组）菌液1 mL，对照组（C组）和高脂组（HC组）每天每只大鼠灌胃无菌生理盐水1 mL。菌液需要每天现用现配，于上午固定时间灌胃。C组饲喂普通饲料，其他3 组饲喂高脂饲料。

1.3.3 体质量增加量与采食量的测定

实验期间，各组大鼠均饲养7 周，每天称量喂食量和剩余饲料量的质量，计算大鼠每天的采食量。每周于固定时间称量大鼠体质量，并按公式（1）计算饲料利用率。

1.3.4 血液采集与检测

从大鼠适应期开始，每两周断尾采血2 mL，采血前将大鼠禁食禁水12 h。将采到的血样置于冰上2 h，4 ℃静置过夜，待血清自然析出，3 000 r/min、4 ℃离心2 min，分离出血清，弃去不溶物，将血清转移至干净的离心管中，保存于－20 ℃冰箱待测。

根据血清胆固醇各指标试剂盒说明书对TC、TG、LDL-C和HDL-C质量浓度进行测定。

1.3.5 粪便含水量检测

将铝盒清洗干净放入烘箱使其烘干至恒质量，在干燥器中冷却后称质量，记录铝盒编号及质量m0/g。每周固定时间采集大鼠新鲜粪便，收集于称质量并编号的铝盒中，再次称质量并记录下总质量m1/g。之后将铝盒放入烘箱中，105 ℃烘48 h后取出铝盒放入干燥器中，待冷却后称质量并记录总质量m2/g。按公式（2）计算粪便含水量。

1.3.6 粪便TBA及TC含量检测

将第7周收集的粪便准确称取1 g放入无菌试管中，按照1∶9（m/V）的比例加入9 倍体积的匀浆介质，冰浴条件下机械匀浆后，2 500 r/min离心10 min，收集上清液。根据TBA试剂盒和TC试剂盒说明书分别测定粪便中TBA和TC的含量。

1.3.7 脏器指数测定

实验最后一周结束前将大鼠禁食12 h后安乐死，立即解剖大鼠，取出其肝脏、脾脏、肾脏，用预冷的生理盐水冲洗肝脏、脾脏和肾脏并用滤纸擦拭干净，称量并记录其质量。从每只大鼠肝脏最大肝叶的同一部位切取1 cmh 1 cm大小的组织块，放入体积分数10%的甲醛溶液中固定24 h。其余组织放入－20 ℃冰箱保存，并尽快进行后续实验。按公式（3）计算脏器指数。

1.3.8 肝脏TC及TG含量的测定

将肝脏组织从－20 ℃冰箱中取出，准确称取1 g组织块于干净的离心管中，在冰浴条件下，以1∶9（m/V）的比例加入Folch溶液（氯仿-甲醇体积比2∶1），用高速匀浆器匀浆。然后4 ℃、5 000 r/min离心2 min，吸取上清液。按照TC和TG试剂盒说明书分别测定肝脏组织中TC和TG的含量。

1.3.9 肝脏组织切片与HE染色

将固定好的肝脏组织块送至兰州大学医学院实验中心制作组织切片。经过包埋、切片、脱蜡、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色等步骤完成组织切片的制作。

1.4 数据统计分析

利用Excel 2007软件整理实验数据，SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析与Duncan氏多重比较。数据肩标字母不同为差异显著（P＜0.05）。用Origin 8.6软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 大鼠体质量增加量、采食量和饲料利用率变化

如表1所示，在体质量增加方面，可以看出HC组大鼠的体质量增加量显著高于其他3 组（P＜0.05）。在采食量上，C组的大鼠采食量显著高于饲喂高脂饲料大鼠的采食量（P＜0.05）。HC组大鼠的饲料利用率显著高于C组、BX56及BX-1组的大鼠的饲料利用率。

表 1 各组大鼠体质量增加量、总采食量和饲料利用率（n＝10）Table 1 Body mass gain, total feed intake and feed utilization rates in rats in each group (n= 10)

2.2 大鼠脏器指数变化

在实验期间各组大鼠食欲正常、毛色光洁，除了人为造成一只大鼠的意外死亡之外，其他大鼠均无死亡，也无异常行为。从表2中可以看出：饲喂高脂日粮组大鼠的肝脏指数显著高于C组大鼠，而BX56和BX-1组大鼠的肝脏指数略低于HC组大鼠，但差异不显著（P＞0.05）。而肾脏指数和脾脏指数在4 组SD大鼠之间没有显著性变化，这说明了灌胃的两种乳酸菌对于SD大鼠没有明显的毒副作用。

表 2 各组大鼠脏器指数（n＝10）Table 2 Organ indexes of rats in each group (n= 10)

2.3 大鼠血清TC质量浓度变化

图 1 大鼠血清TC质量浓度变化Fig. 1 Changes in serum total cholesterol content in SD rats

从图1中可以看出，在第1周时4 组大鼠的血清TC质量浓度差异不显著。到第3周时HC组、BX56组和BX-1组大鼠的TC质量浓度较C组明显升高，且差异显著 （P＜0.05），这表明给大鼠饲喂高脂饲料后，在第3周时高脂动物模型已经基本建立。从第5周开始，BX56及BX-1组大鼠血清TC质量浓度与HC组比较，均有所下降，且BX-1组与HC组之间差异显著（P＜0.05），而BX56组与HC组之间差异不显著。

2.4 大鼠血清TG质量浓度变化

图 2 大鼠血清TG质量浓度变化Fig. 2 Changes in serum triglyceride content in SD rats

如图2所示，从第3周开始，饲喂高脂日粮的3 组大鼠的血清TG质量浓度开始显著高于C组（P＜0.05）。第5周时，HC组大鼠血清中TG质量浓度显著高于C组大鼠和BX-1组大鼠（P＜0.05），而BX56组大鼠血清TG质量浓度对比HC组虽然有所下降，但差异并不显著。

自第3周起，饲喂高脂饲料大鼠的血清TC和TG质量浓度就明显高于C组大鼠，说明了本实验中SD大鼠高脂模型已基本建立。这一结果表明，在饲料中添加胆固醇和油脂类物质可以诱导实验动物脂类物质代谢紊乱，从而引起血清胆固醇和TG质量浓度的升高。这种通过在饮食中增加胆固醇和脂肪质量浓度来建立高血脂动物模型的方法已被很多研究所采用。

2.5 大鼠血清LDL-C质量浓度变化

图 3 大鼠血清LDL-C质量浓度变化Fig. 3 Changes in serum low-density liptein cholesterol levels in SD rats

如图3所示，从第3周开始HC组、BX56组及BX-1组大鼠的LDL-C质量浓度显著高于C组大鼠，而从第5周开始，BX-1组大鼠的LDL-C质量浓度开始显著低于HC组（P＜0.05），而BX56组大鼠的LDL-C质量浓度与HC组之间并没有显著性差异。

2.6 大鼠血清HDL-C质量浓度变化

如图4所示，血清HDL-C质量浓度在4 组大鼠之间差异性不显著，但从总体来看，灌胃乳酸菌的两组大鼠HDL-C质量浓度略高于HC组，这说明灌胃乳酸菌罗伊氏乳杆菌BX56和瑞士乳杆菌BX-1对于HDL-C质量浓度有一定影响，但是效果并不明显。

从以上结果可以看出，灌胃瑞士乳杆菌BX-1可以有效降低SD高脂大鼠血清中的TC、TG和LDL-C的质量浓度，但是对HDL-C的质量浓度影响不大。

图 4 大鼠血清HDL-C质量浓度变化Fig. 4 Changes in serum high-density liptein cholesterol levels in SD rats

2.7 大鼠粪便含水量变化

图 5 大鼠粪便含水量变化Fig. 5 Changes in fecal water content in SD rats

由图5可知，C组大鼠的粪便含水量最高，保持在60%左右，这与各组大鼠所喂食的饲料成分有很大的关系。而灌胃乳酸菌BX56和BX-1的两组大鼠粪便含水量比HC组大鼠粪便含水量要高。

2.8 大鼠粪便TC和TBA含量变化

图 6 不同处理组大鼠粪便TC含量Fig. 6 Fecal total cholesterol levels in SD rats in different groups

如图6所示，BX-1组大鼠粪便TC含量显著高于C组（P＜0.05），而BX56组、HC组及C组间大鼠粪便TC含量差异不显著。

从图7可以看出，HC、BX56、BX-1组大鼠粪便中TBA的含量显著高于C组（P＜0.05），同时BX-1组的大鼠粪便中TBA含量也显著高于其他3 组（P＜0.05）。综上来看，BX-1组大鼠粪便中TC含量高于HC组大鼠，但差异不显著；TBA的含量显著高于HC组大鼠，而BX56组大鼠的TC、TBA含量与HC组大鼠相比差异不显著。

图 7 不同处理组大鼠粪便TBA含量Fig. 7 Fecal total bile acid content in SD rats in different groups

2.9 大鼠肝脏TC和TG含量变化

图 8 不同处理组大鼠肝脏TC含量Fig. 8 Total cholesterol levels in the liver of SD rats in different groups

图 9 不同处理组大鼠肝脏TG含量Fig. 9 Triglyceride levels in the liver of SD rats in different groups

如图8、9所示，饲喂高脂饲料的大鼠肝脏中TC和TG含量远高于C组，但是灌胃瑞士乳杆菌BX-1的大鼠肝脏中TC、TG的含量显著低于HC组（P＜0.05），灌胃罗伊氏乳杆菌BX56的大鼠的肝脏TG含量虽然也显著低于HC组，但肝脏TC含量与HC组相比差异并不显著。

2.10 大鼠肝脏组织HE染色结果

图 10 大鼠肝脏组织HE染色Fig. 10 Histological examination by hematoxylin-eosin staining of SD rat liver tissues

根据前期得到的血清、肝脏以及粪便中的数据可知，罗伊氏乳杆菌BX56在大鼠体内降低胆固醇的能力并不理想，因此不再做该组大鼠肝脏组织HE染色。

由图10A可知，正常的肝脏细胞，细胞核位于细胞中央，核大而圆，细胞呈索状排列，胞浆为红色。由图10B可知，HC组大鼠的肝脏有严重的脂肪肝病变。该组大鼠肝脏细胞呈圆形，细胞内部充满了脂肪空泡，红色胞浆较少，内有较多微小脂滴，细胞核被脂肪泡挤至细胞边缘，肝窦受压。由图10C可以看出，该组大鼠肝脏组织虽然也有不同程度的脂肪浸润，但是总体看来，细胞内部的脂肪泡数量较HC组少很多，胞浆呈现红色，并且还有正常形态的肝脏细胞存在。由此可知，瑞士乳杆菌BX-1可以减少脂肪在肝脏细胞中的浸润，保护肝脏细胞。

3 讨 论

乳酸菌已成为治疗人类和动物肠道疾病的一种益生菌，大量研究已经证明部分乳酸菌能够在体外和体内都起到降胆固醇的作用。本研究通过建立SD大鼠高脂模型，并灌胃乳酸菌进行干预，通过比较大鼠血清、粪便以及肝脏各指标来初步探究降胆固醇乳酸菌对高脂模型大鼠的益生作用。

实验期间，灌胃乳酸菌的两组大鼠的体质量增加量显著低于高脂组大鼠的体质量增加量。这可能是由于灌胃乳酸菌后会影响大鼠的脂质代谢，在一定程度上减少了大鼠的体质量增加量。有研究已经证明一些乳酸菌菌株能够有效抑制由高脂饮食引起的大鼠体质量的过度增加[22]。

Bazzare等[23]在1983年就已经提出，摄入益生乳酸菌对人类也许是最为安全有效的降低血清胆固醇的方法。Nguyen等[24]用从婴儿粪便中分离得到的植物乳杆菌PH04灌胃高胆固醇血症的大鼠，发现灌胃乳酸菌组大鼠血清TC和TG的含量相比于C组都分别降低7%和10%，表明植物乳杆菌PH04在降低胆固醇方面能发挥有效的益生作用。本实验中BX-1组SD大鼠的血清TC、TG和LDL-C质量浓度要显著低于高脂组大鼠，但是血清HDL-C质量浓度没有显著差异。这表明菌株BX-1可以有效降低高脂大鼠血清中TC、TG和LDL-C的含量，但是对HDL-C含量的影响不大。李梅等[25]以不同剂量的两株双歧杆菌饲喂高脂血症模型大鼠后，得出这两株双歧杆菌均能显著降低大鼠血清TG和TC含量，但是对HDL-C的含量没有显著影响。这与本实验中所得出的结论相符。但是， 肖琳琳等[26]将分离到的一株干酪乳杆菌用于高血脂小鼠进行体内的降血脂作用研究，结果证实菌液组小鼠与对照组小鼠相比，血清中TC和TG浓度显著降低，同时HDL-C浓度增加。Hashimoto等[27]也发现干酪乳杆菌可以增加HDL-C的浓度。

正如预期所料，摄入高脂饲料会导致肝脏TC和TG含量的升高，但灌胃瑞士乳杆菌BX-1组大鼠的肝脏TC和TG含量均显著低于高脂组大鼠。同时为了全面评价乳酸菌的降血脂作用，制作了大鼠肝脏组织切片，通过HE染色，在显微镜下可以看出：BX-1组大鼠肝脏细胞中的脂肪空泡要明显少于高脂组大鼠，其肝脏组织形态也更接近于正常大鼠，这进一步表明瑞士乳杆菌BX-1可以明显改善脂类物质在大鼠肝脏中的沉积，起到保护肝脏细胞的作用，这可能是因为解共轭胆盐和胆固醇共同沉淀致使肝脏中的胆固醇会形成新的胆酸进入肝胆循环，从而可降低肝脏中胆固醇的含量。此外，虽然灌胃瑞士乳杆菌BX-1组的大鼠肝脏脂质沉积减少了，肝脏指数也显著低于高脂组，但仍高于C组，这可能与长期摄入高剂量的高脂饲料有关。胡梦坤[28]、Xie Ning[29]等的研究中也得出了相同的结论。

Usman[30]和Jeun[31]等关于乳酸菌在降低大鼠血清胆固醇的实验中发现大鼠体内胆固醇水平降低的同时粪便中胆酸的含量显著高于C组。本实验中灌胃瑞士乳杆菌BX-1组的大鼠粪便中的胆汁酸含量要高于高脂组，这可能是由于瑞士乳杆菌BX-1所产生的胆盐水解酶在肠道内对胆盐的解共轭作用使得脱结合的胆酸量在粪便中显著增加。已有研究发现，部分乳酸菌能够产生胆盐水解酶，这种胆盐水解酶可以将胆盐水解为游离态的胆酸，脱结合的游离胆酸在小肠中比结合态的胆酸更难吸收，并且比结合态的胆酸更快排泄，更易于与膳食纤维和肠道细菌黏附，结果造成了粪便中胆酸含量的增加。与此同时，胆酸的重吸收减少，又使得肝脏中的胆固醇被分解合成胆酸参与肝胆循环，从而降低了体内TC的 含量[32-33]。因此，通过体内实验进一步证明，乳酸菌在体内降胆固醇的作用与胆酸的代谢息息相关。

灌胃瑞士乳杆菌BX-1组的大鼠虽然也长期摄入高脂饲料，但是其粪便的含水量要比高脂组高4.4%。Wang Yanping等[34]报道用植物乳杆菌MA2灌胃高脂模型大鼠5 周后发现，灌胃乳酸菌的大鼠粪便含水量比高脂组大鼠平均高了7%，这与本实验结果相似，同时也表明瑞士乳杆菌BX-1和罗伊氏乳杆菌BX56在一定程度上可以增加粪便含水量，具有潜在的润肠通便的能力。

最后，灌胃罗伊氏乳杆菌BX56组的大鼠，其粪便胆固醇和肝脏胆固醇的水平与对照相比差异不显著，粪便胆汁酸和肝脏TG的水平与对照相比差异显著。这可能是由于BX56不产胆盐水解酶，在肠道内无法水解共轭胆盐，因此无法促进胆固醇参与肝胆循环来降低体内胆固醇的含量，只通过菌体细胞自身吸收同化部分胆固醇，所以在体内降胆固醇效果并不明显。大量实验证明，乳酸菌在代谢中产生的胆盐水解酶具有沉淀去除胆固醇的能力[23]，但也有实验证明，某些不产胆盐水解酶的乳酸菌也能很好地降解胆固醇[35-36]。目前降解胆固醇的机理还不完全清楚，有待进一步的实验研究。

4 结 论

本实验结果表明，从青藏高原传统发酵牦牛酸奶中分离纯化出来的瑞士乳杆菌BX-1在高脂模型大鼠中表现出良好的降低血清及肝脏TC、TG水平的能力和促进胆固醇、胆汁酸排出体外的能力，为进一步开发预防和治疗胆固醇高血脂症的益生菌制剂提供了理论依据，但其降解胆固醇的机理还需进一步的研究。可以进一步从基因入手，通过研究乳酸菌对体内胆固醇代谢相关基因的影响，来发现其具体的降胆固醇作用机制。