高压均质对蓝藻有机质释放与厌氧发酵产酸的促进效果

余甜甜, 王率率, 张 杰, 郑志永,3, 刘 和,3, 刘宏波,3*

1.江南大学环境与土木工程学院, 江苏省厌氧生物技术重点实验室, 江苏 无锡 214122

2.无锡市滨湖区水利局, 江苏 无锡 214071

3.江苏省水处理技术与材料协同创新中心, 江苏 苏州 215009

我国淡水湖泊普遍存在不同程度的富营养化状态，《2017中国生态环境状况公报》[1]数据显示，109个监测营养状态的湖泊(水库)中，轻度富营养化与中度富营养化的湖泊共有33个，占比为31%. 我国富营养化的水质状态导致蓝藻广泛爆发[2]，严重影响了周边区域环境与生态平衡. 目前最为有效抑制水华蓝藻泛滥的措施是通过打捞降低沿岸水域的藻类有机物质含量[3]，减缓水质恶化，改善水体环境. 但是，在蓝藻爆发时期，仅太湖流域每天蓝藻的打捞量可达2.6×104t[4]，打捞出来的蓝藻由于含水率极高，给运输、储存及处理带来了很大的困难. 如果不能提高蓝藻的处置消纳能力以平衡蓝藻的打捞量，则是将污染物从湖泊转移到陆地上，给陆地环境造成极大威胁. 因此，开发出高价值蓝藻生物质资源化技术，是解决蓝藻水华治理的重要途径之一.

蓝藻厌氧发酵是蓝藻资源化利用的方法之一[5]，通过厌氧发酵使蓝藻中的有机质转化为挥发性脂肪酸，产物可作为碳源回收利用，以达到资源化处理的效果. 但蓝藻发酵过程中微生物可利用的溶解态有机质含量较低，导致产酸效率不高[6]. 由于大部分营养物质在细胞内部，而蓝藻由肽聚糖及纤维素构成的双层细胞壁包裹，外围通常存在由粘性多糖组成的胶鞘[7]，其独特的细胞结构导致一些破壁技术难以将蓝藻细胞破碎完全，结构蛋白与多糖很难溶出. 为了充分利用蓝藻细胞内丰富的有机质，选择适合的蓝藻细胞破壁效率显得尤为重要. 目前已公开多种藻类破壁技术，如超声波破壁[8]、热碱水解[9]、反复冻融技术[10]等. 其中，热碱水解技术具有破碎效果好、有机质释放率高、操作简单等优点，但处理时间长，且加热导致的气体蒸发具有恶臭，产生了大气二次污染；超声破碎技术利用空穴效应使蓝藻内容物释放，处理时间短、无需额外投加药剂，但不足之处是处理量较小，无法规模化应用；而反复冻融技术，将蓝藻反复冻融，利用冰晶生长使蓝藻细胞破壁，该方法效率低、能耗高，多用于实验室研究.

高压均质是近年来发展起来的一种预处理方法[11]，通过对物料细胞进行撞击、剪切，物料会同时受到高频振荡、高速剪切、空穴现象和对流撞击等机械力作用和热效应，使物料的组织结构被破坏，达到均质的效果，具有破碎效果完全、连续式运行，处理时间短、不产生二次污染且可扩大生产等优势. 国内外将该技术主要用于食品行业的生产，对乳品、乳剂进行处理[12].

目前，对蓝藻进行预处理以提高厌氧发酵碳源回收率的研究[13-16]已经开展，但关于蓝藻进行高压均质破壁影响发酵产酸的效果尚不清楚. 因此，笔者将从蓝藻有机物、氮、磷、细胞微观形态、脱水性能和可生化性等方面，分析高压均质处理对蓝藻理化性质的影响及其作用机理，通过比较均质预处理蓝藻、未处理蓝藻及热碱处理蓝藻的产酸情况，评估该预处理技术对蓝藻厌氧发酵的促进效果，以期为蓝藻碳源回收的应用提供数据支持.

1 材料与方法

1.1 原料

蓝藻采自太湖水体，含水率约为97%. 蓝藻采集后滤去浮萍、水草等杂物，分装在若干样品瓶中，放入冷藏柜储存备用.

厌氧发酵产酸种泥取自用于处理柠檬酸废水的UASB(升流式厌氧污泥床)反应器的厌氧发酵产酸污泥，经两次清水冲洗后使用，蓝藻和种泥的性质如表1所示.

1.2 试验方案

表1 蓝藻和种泥的基本性质

注： TS为总固体；VS为挥发性固体；TCOD为总化学需氧量；SP为溶解性蛋白质；WSC为溶解性碳水化合物. 1)表示以TS计.

1.2.1不同压力条件的高压均质试验

试验中蓝藻高压均质预处理采用GEA-NIRO-SOAVI型高压均质机(意大利凯派克斯科技有限公司). 准确称取一定量蓝藻，过100目(孔径0.15 mm)筛后加入去离子水，调节w(TS)至3%，进入高压均质机，将均质压力分别设置为60、80、100和120 MPa，在增压设备的作用下，高压溶液快速通过均质腔，受到均质阀撞击、高速剪切等机械力，均质完成后收集出料口蓝藻溶液待测. 对照组为未经预处理的蓝藻溶液，试验蓝藻均未调节pH(约为6.58).

1.2.2不同pH条件的高压均质试验

准确称取一定量蓝藻，过100目(孔径0.15 mm)筛后加入5 molL NaOH溶液分别将pH调至8、9、10、11、12，并调节w(TS)至3%，进入高压均质机，根据均质压力试验结果设置优化后的均质压力. 均质处理后收集出料口蓝藻溶液待测. 对照组为未经预处理的蓝藻溶液.

1.2.3热碱试验

热碱处理普遍被视为细胞破壁的常规方法，如在污泥中常采用热碱法进行预处理促进发酵产酸[17]，故该研究将热碱处理作为参照，对比评价高压均质的水解效果. 试验步骤：①称取一定量蓝藻，加入5 molL NaOH将pH调至11，并调节w(TS)至3%；②90 ℃ 下水浴加热2 h；③热碱处理后将溶液冷却称量，加入去离子水将溶液补充至热碱处理前的质量，搅拌均匀后待测.

1.2.4厌氧发酵产酸试验

蓝藻发酵产酸采取序批式摇瓶试验. 向高压均质后的蓝藻中加入种泥和溴乙烷磺酸钠(BES，产甲烷抑制剂)，种泥接种率为10%；c(BES)为50 mmolL. 将混合液移入500 mL厌氧瓶中，顶空预留150 mL体积，持续冲入99.9%的高纯氮气20 min，以去除顶空及混合液中的氧气，厌氧瓶完全密闭，放入转速为120 rmin、35 ℃的恒温培养摇床中. 对照组底物为未经预处理的蓝藻溶液，热碱组底物为热碱预处理后的蓝藻溶液.

1.3 分析方法

蓝藻中ρ(TS)、ρ(VS)、ρ(TP)均采用国家标准方法测定[22]；使用pH酸度计测定pH；使用激光粒度分布仪测定蓝藻粒径；使用毛细吸水时间测定仪测定蓝藻CST(毛细吸水时间)；使用BOD测定仪测定BOD5(五日生化需氧量). 采用气相色谱法测定ρ(VFAs)[23]，测量仪器为日本岛津公司生产的2010型气相色谱，主要配置：AOC-20i自动进样器，FID检测器，PEG-20M色谱柱(30 m×0.32 mm×0.5 μm，大连中北分析仪器)；采用一阶程序升温，初温80 ℃，保持3 min，然后以15 ℃min的速率升至200 ℃，保持2 min. 载气为氮气，尾吹流量30 mLmin. 进样室(SPL)和检测器(FID)的温度都设为250 ℃.

蓝藻溶出率计算公式：

R=(Ci-C0)Ct×100%

(1)

式中：R为溶出率，%；Ci为预处理后蓝藻的SCOD质量浓度，gL；C0为预处理前蓝藻的SCOD质量浓度，gL；Ct为预处理前蓝藻TCOD的质量浓度，gL.

2 结果与讨论

2.1 高压均质对蓝藻营养物质释放的影响

2.1.1高压均质对蓝藻碳源释放的影响

高压均质处理可以极大地促进蓝藻营养物的释放. 由图1可见，对照组ρ(SCOD)为0.43 gL，经过高压均质后，蓝藻溶液中ρ(SCOD)随均质压力的增加而升高，在120 MPa压力下达到最高值(11.05 gL)，溶出率为42.57%；100 MPa时ρ(SCOD)为10.35 gL，溶出率为39.87%；同时，高压均质处理后的蓝藻ρ(SP)及ρ(WSC)也呈相同趋势，120 MPa时ρ(WSC)由对照组的0.19 gL升至4.05 gL，ρ(WSC)由0.13 gL增至4.45 gL. 对不同压力下的SCOD、SP、WSC进行显著性分析，虽然蓝藻各项溶解性有机质指标在120 MPa时达到最高，但100 MPa下有机质释放效果与120 MPa下没有统计学差异，考虑到能耗因素，故在后续试验均采用100 MPa的均质压力.

图1 不同条件下高压均质蓝藻的ρ(SCOD)、ρ(SP)、ρ(WSC)和溶出率Fig.1 SCOD concentration, SP concentration, WSC concentration and solution rateunder different high-pressure homogeneous conditions

由图1可见，在100 MPa、不同pH下高压均质蓝藻释放到液相中的有机质含量随pH的升高而增加，pH=8时，ρ(SCOD)为14.20 gL，溶出率为54.70%，比对照组蓝藻(pH约为6.58)的溶出率高37.20%；pH=12时，ρ(SCOD)最高，达22.74 gL，溶出率为87.59%，比对照组提高了52.34倍.ρ(SP)与ρ(WSC)也达到最高值，分别为8.59和6.81 gL. pH的升高促进有机质溶出率的增加，其原因可能是细胞破碎后，部分蛋白质与多糖仍黏附在细胞碎片上，没有完全溶出；碱的投加可以提高有机质的溶解效率[24]，并促进细胞壁上的结构蛋白与多糖溶解，使溶解性有机质含量显著提高.

图2 不同条件下高压均质蓝藻的ρ(NH4+-N)与ρ(TP)Fig.2 Concentration of NH4+-N and TP under different high-pressure homogeneous conditions

2.1.2高压均质对蓝藻氮磷释放的影响

随着均质压力和pH的提高，蓝藻NH4+-N与TP的释放量快速增加. 由图2可见，60 MPa时，ρ(NH4+-N)由对照组的13.08 mgL增至39.40 mgL；ρ(TP)由0.40 mgL升至4.47 mgL；且120 MPa时ρ(NH4+-N)与ρ(TP)均达到最高值，分别为50.04和8.80 mgL. 随着pH的升高，ρ(TP)呈升高趋势，因蓝藻细胞对磷的吸收能力强，在磷充足的情况下，新鲜蓝藻通过生成多聚磷酸将水体中大量磷元素储存于细胞中[25]，高压均质处理后，蓝藻细胞破裂，细胞内的磷释放到水体中，导致ρ(TP)上升，pH=12时ρ(TP)达到最大值，为24.80 mgL，是对照组的62.00倍. 同时，ρ(NH4+-N)同样随着碱的加入而显著升高，在pH=12时达到最大值(115.70 mgL)，是对照组的8.90倍，NH4+-N是影响后续发酵产酸试验的重要指标，ρ(NH4+-N)过高时，会抑制蓝藻后续的厌氧发酵产酸过程[26].

由图1、2可见，在100 MPa和pH=12下，蓝藻营养物的释放量可以达到最高值. 但pH过高，所需要的碱量大，且均质机在长期连续运行下会造成一定程度的腐蚀，不适用于工业化使用. pH=11时，蓝藻溶解性有机质释放效率与pH=12时的效果相似(P>0.05)，且NH4+-N释放量较少(P<0.05)，因此选择100 MPa和pH=11作为蓝藻均质优选工况.

2.2 高压均质对蓝藻微观结构及细胞破解效果的影响

2.2.1高压均质对蓝藻微观形态的影响

不同预处理下蓝藻颗粒的粒径分布如图3所示. 由图3可见，经过预处理后，溶液中的颗粒粒径显著减小，表现为对照组蓝藻>热碱组蓝藻>高压均质组蓝藻，其中对照组蓝藻体积平均粒径为39.92 μm，热碱组为19.33 μm，高压均质Ⅰ组(100 MPa，pH=9)、Ⅱ组(100 MPa，pH=11)的体积平均粒径分别为8.91和7.89 μm. 如图3所示，蓝藻溶液的粒径分布比例(相同粒径颗粒的体积之和占总颗粒体积之比)呈现两个峰(用a、b表示)，原蓝藻溶液的峰值主要出现在3～8 μm(a1峰)和50～80 μm(b1峰)范围之间. 而蓝藻单个细胞粒径大多在3～10 μm之间[27]，与a1峰所在粒径范围重合，可知a1峰代表着溶液中游离的单个蓝藻细胞，而b1峰则是溶液中聚集的粒径较大的藻团[28]. 而a2峰(热碱组)值比a1峰(对照组)值高出1倍以上，说明热碱处理使溶液中的藻团和胞外聚合物分解为小颗粒物质. 均质处理后，高压均质Ⅰ、Ⅱ组曲线的b峰左移，与代表蓝藻单个细胞粒径的波峰重合，说明高压均质将聚集在一起的藻团打碎，变成单个细胞或较小的藻团，小颗粒的占比增加；同时，在0.1～1 μm范围内出现峰值(a3、a4)，说明高压均质对蓝藻细胞壁破碎较为彻底，产生大量细胞碎片. 其中，高压均质Ⅰ组a4峰值为1.82%，比高压均质Ⅱ组a3峰值(0.76%)高，原因可能是溶液中的碱促进了蓝藻细胞碎片的溶解[29]，使代表细胞碎片与其他小颗粒物质的左侧峰值增加.

图3 不同预处理下蓝藻的粒径分布Fig.3 Average particle diameter of different pretreated cyanobacteria

2.2.2高压均质对蓝藻破壁效果的影响

除去蓝藻溶液中本身存在的部分衰老、凋亡的细胞释放出DNA外，其余核酸类物质均储存在蓝藻细胞内，因此液相中ρ(DNA)的变化可作为衡量细胞破壁效果的重要指标[30]. 高压均质Ⅰ组、高压均质Ⅱ组、热碱组及对照组蓝藻离心分离获得的上清液中ρ(DNA)如图4所示. 由图4可见，对照组为未经过处理的蓝藻，ρ(DNA)仅为1.04 ngμL，绝大多数蓝藻细胞并未破裂；经过预处理后，热碱组ρ(DNA)升至22.60 ngμL，大部分细胞壁在高温和碱的作用下破裂，ρ(DNA)显著升高；高压均质Ⅰ、Ⅱ组的ρ(DNA)也分别升至24.17、29.24 ngμL，分别比对照组提高了22.24、27.12倍，故两种预处理均有较好的破壁效果，而高压均质处理通过撞击、剪切等机械力作用于蓝藻细胞，使细胞破碎程度更彻底，胞内物质释放更完全.

图4 不同预处理下蓝藻上清液中ρ(DNA)Fig.4 DNA concentration in supernatant of different pretreated cyanobacteria

2.3 高压均质对蓝藻有机物可生化性的影响

高压均质蓝藻及热碱预处理蓝藻有机物的可生化性指标数值结果如图5所示. 由图5可见，高压均质预处理及热碱预处理均能促进SCOD释放. 对照组ρ(SCOD)仅为0.43 gL，而热碱处理后ρ(SCOD)升至15.64 gL，高压均质处理后ρ(SCOD)也分别升至16.85 gL(高压均质Ⅰ组)和22.30 gL(高压均质Ⅱ组). 值得注意的是，热碱组与高压均质Ⅰ组SCOD释放量相近，但ρ(BOD5)却相差显著(P<0.01)，热碱组ρ(BOD5)仅8.13 gL，而高压均质Ⅰ组ρ(BOD5)可达11.08 gL，比热碱组高出36.29%. 其原因可能是，热碱预处理破碎蓝藻细胞时，有机质中的酰胺类物质(蛋白质、多肽、氨基酸)与还原糖在高温与高pH下易发生美拉德反应，形成难以被微生物降解的褐色的多聚氮化合物[31]，导致可生化性降低.

图5 不同预处理下高压均质对蓝藻可生化性的影响Fig.5 Effect of high-pressure homogenization on biodegradability of cyanobacteria

图6 高压均质蓝藻厌氧发酵时VFAs的质量浓度及各酸分布比例Fig.6 Variation of VFAs concentration and organic acid composition in anaerobic fermentation of high-pressure homogeneous cyanobacteria

2.4 高压均质对蓝藻厌氧发酵产酸的影响

分别使用高压均质Ⅰ组、高压均质Ⅱ组、热碱组及对照组蓝藻进行厌氧发酵. 厌氧发酵产生VFAs的情况如图6(a)所示. 对照组产酸15 d后ρ(VFAs)达3.80 gL；热碱组蓝藻ρ(VFAs)为6.15 gL；高压均质Ⅰ组ρ(VFAs)在10 d后趋于稳定，最高值达7.84 gL，高于热碱组27.48%；高压均质Ⅱ组ρ(VFAs)最高为8.22 gL，比热碱组提高33.66%，是对照组的2.16倍.

蓝藻多数有机质存在于细胞内部，被细胞壁包裹，胞外含有部分粘性多糖与蛋白质，未经预处理的蓝藻在厌氧发酵过程中仍存在形态完整的细胞，大部分胞内有机物无法被微生物利用[32]，故对照组蓝藻的ρ(VFAs)最低. 控制厌氧发酵反应的因素有很多，产酸菌、碳源、培养环境等都可以影响其产酸效率. 采用预处理技术后，蓝藻细胞内有机质释放到液相中，增加了微生物的碳源含量，因而高压均质及热碱处理后蓝藻ρ(VFAs)均有提升；且相比于热碱组，高压均质组ρ(VFAs)更高，这是由于高压均质蓝藻提供给产酸菌的碳源品质更高，即可生化性优于热碱蓝藻. 从每单位(以质量计)SCOD产生VFAs来比较，高压均质Ⅰ组比高压均质Ⅱ组高，可能是因为产酸菌在强碱环境下其活性受到了一定影响[33]，这与HUANG等[34]的研究结果相符，他们比较了不同pH下厌氧发酵时微生物的多样性，认为pH为10～11下的微生物多样性明显小于pH为7～9下的微生物多样性. 但从产酸总量来看，高压均质Ⅱ组高于高压均质Ⅰ组，这是由于pH升高提高了有机物溶出率；因发酵产酸的限速步骤是水解反应，强碱条件下大量的有机物被释放和水解，为产酸菌提供了充足的底物，此时底物浓度升高对发酵的促进作用大于高pH下所产生的抑制作用[35].

蓝藻厌氧发酵产生的挥发性脂肪酸中各单酸含量占比情况如图6(b)所示. 各组发酵液中均存在乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸，其中，异丁酸、异戊酸和戊酸占比较低且在各试验组中差异不大；而剩下3种酸中乙酸占比始终最高，对照组、热碱组、高压均质Ⅰ组、高压均质Ⅱ组的乙酸占比分别为3.58%、57.71%、45.15%和56.04%，说明碱性条件下更适合蓝藻厌氧发酵中乙酸的积累[36]. 除乙酸外，对照组与高压均质Ⅰ组丁酸含量最高，而热碱组与高压均质组Ⅱ的丙酸含量却超过丁酸，主要是由于丙酸型厌氧发酵微生物比丁酸型微生物更适宜于在碱性的环境中生长[37].

2.5 高压均质对蓝藻脱水性能的影响

蓝藻的脱水性能是影响VFAs回收率的关键因素之一. 蓝藻CST变化情况如图7所示，由图7可见，对照组的CST为684 s，而热碱处理蓝藻的CST飙升至 2 940 s，这是由于热碱处理使蓝藻细胞破碎，大量有机质被释放，而溶出的蛋白质与多糖等物质会与水分子结合，导致自由水含量下降、蓝藻黏度升高，CST升高. 而高压均质Ⅰ、Ⅱ组的CST分别为 1 368、1 940 s，同样是因胞内蛋白质与多糖的大量释放致使高压均质处理的蓝藻比处理前蓝藻的脱水性差；但与热碱组相比，高压均质Ⅰ、Ⅱ组的CST却显著降低，这是由于高压均质处理通过撞击与剪切等机械作用力破坏了细胞与絮体的结构，释放出间隙水与结合水，蓝藻的流态性明显增强，减缓了因细胞破壁导致的脱水性能恶化[38]，从而降低了从蓝藻中回收碳源的难度.

2.6 高压均质对蓝藻预处理效果的综合评价

高压均质处理、热碱处理、未处理蓝藻的有机质释放和发酵产酸效果如表2所示. 由表2可见，高压均质的有机质溶出率高于热碱处理的48.67%，说明高压均质处理能增加液相中的有机物浓度，给微生物提供更多碳源；另外，高压均质处理的BC比未处理蓝藻提高34.04%，具有增强有机物可生化性的作用，提高了厌氧发酵中底物的碳源品质；高压均质蓝藻产酸率为0.32 gg〔以w(VFAs)w(VS)计〕，比热碱处理高出33.33%. 高压均质对蓝藻破壁与厌氧发酵除了具有良好的促进效果外，还具有处理时间短、连续运行的优点，单位时间处理量大，具有良好的工业应用前景.

表2 不同预处理效果对比

注：1) 表示以w(VFAs)w(VS)计.

3 结论

a) 高压均质对蓝藻细胞具有良好的破壁效果，能够促进胞内营养物质释放.

b) 高压均质能提高蓝藻可生化性，促进厌氧发酵产酸. 高压均质后BC提高至0.63，ρ(VFAs)最高达8.22 gL，是一种能够有效促进蓝藻厌氧发酵产酸的处理方法.

c) 高压均质能降低从蓝藻中回收碳源的难度. 在有机物释放量更大的情况下，高压均质蓝藻的CST比热碱蓝藻的更低，减缓了有机物释放造成的蓝藻脱水性能恶化的趋势.