mortalin蛋白在宫颈鳞癌中的表达及其对肿瘤转移能力的影响*

王馨悦，李 楠，董 兵，杨 洋，林贞花

(延边大学医学院病理学教研室， 吉林省科技厅重点实验室， 吉林 延吉 133002)

子宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，近年来，其发病率呈年轻化趋势发展[1]。目前，子宫颈癌患者的死亡率位居女性恶性肿瘤首位，全球每年约有50万新增病例，其中，28万患者死于子宫颈癌[2]。子宫颈鳞癌是子宫颈癌最常见的组织学分型，发病隐匿，预后较差，严重威胁女性的生命健康。因此，寻找有效的治疗靶点及预后生物标记物对子宫颈癌患者的早期诊断及预后评估至关重要。

寿命蛋白(mortalin)属于热休克蛋白70家族成员之一，最早被发现于小鼠胚胎成纤维细胞中，广泛分布于胞浆及多个细胞器中[3]。研究表明，mortalin参与调控细胞周期、外界应激和肿瘤发生等多种生物学过程[4]，且在卵巢癌[5]、颅脑肿瘤[6]和结肠癌[7]等多种恶性肿瘤中高表达，并与肿瘤的转移密切相关，但mortalin与子宫颈癌演进之间的关系尚未见报道。为此，本文旨在应用免疫组化法检测mortalin在正常宫颈上皮组织和子宫颈鳞癌组织中的差异表达情况，并探讨其表达水平与子宫颈鳞癌患者临床病理参数及子宫颈鳞癌转移之间的关系，进而为子宫颈鳞癌预后评估提供可能的分子指标。

材 料 和 方 法

1 临床材料

临床资料及随访信息齐全的宫颈组织标本选自2006年～2014年延边大学医学院肿瘤组织库，部分购自上海芯超科技有限公司，包括59例正常宫颈上皮组织标本和93例子宫颈鳞癌组织。统计93例子宫颈鳞癌标本的临床病理资料，包括：年龄<50岁的有51例，≥50岁的有42例；肿瘤<3.0 cm的有38例，≥3.0 cm的有55例；组织学分级Ⅰ级12例，II级66例，III级15例；依据国际TNM分期标准，0～II期63例，III～IV期30例；有淋巴结转移者26例，无淋巴结转移者67例。

2 试剂

mortalin抑制剂MKT-077购自Sigma；DMEM 培养基和新生牛血清 FBS 购自Gibco；荧光II抗及DAPI购自Invitrogen；抗E-cadherin、vimentin及 Snail抗体购自CST；抗mortalin抗体购自Abcam；抗β-actin抗体以及罗丹明标记的II抗购自中杉金桥公司。

3 方法

3.1免疫荧光染色 将SiHa细胞铺于0.1 mm厚度的盖玻片上，于5% CO2培养箱中培养，待细胞长至50%后，加入多聚甲醛室温下固定15 min，以0.5%的Triton X-100 细胞打孔10 min，3% BSA室温封闭2 h，滴加 I 抗(抗mortalin抗体1 ∶200 稀释)，4 ℃过夜；荧光Ⅱ抗Alexa Fluro 488标记，室温避光孵育1 h，DAPI封片固定；用激光共聚焦显微镜观察荧光染色结果，并照相记录。

3.2MTT实验检测细胞活力 取对数生长期的SiHa细胞经胰酶消化、重悬，按每孔100 μL接种于96孔板内，每孔含2×104个细胞，设5个复孔；待细胞贴壁后按药物浓度梯度加入mortalin抑制剂MKT-077，并按给药时间梯度分别加入MTT(5 g/L)，4 h后加入二甲基亚砜溶液，振荡10 min后用酶标仪在490 nm波长检测吸光度(A)值并绘制细胞生长曲线。

3.3细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移能力 细胞常规消化、铺板，待细胞长至80%用10 μL无菌枪头沿孔底呈“一”字形划痕，PBS液洗细胞3次后，加入无血清培养液培养，并分别于0、24和48 h拍照。

常规消化、计数细胞，取3×105个细胞，用100 μL无血清培养液重悬细胞后加入Transwell小室上室内，将1 mL含10%血清的培养液加入下室，37 ℃培养箱培养 24 h后甲醇固定，苏木素染色，中性树脂封片、拍照。

3.4Western blot检测蛋白水平 RIPA裂解液裂解细胞后提取蛋白；BCA 法测定蛋白浓度；SDS-PAGE进行蛋白分离，转至 PVDF 膜上；5% 脱脂奶粉摇床封闭2 h；加入 I 抗4 ℃ 过夜；TBS-T洗膜后加入 II抗；孵育 2 h；ECL曝光。

3.5免疫组化染色 制备4 μm厚连续切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，抗原修复，滴加抗mortalin抗体(稀释比例1∶50)，4 ℃孵育过夜；次日滴加 II 抗，DAB显色，苏木素对比染色，中性树胶封片。为证明mortalin抗体免疫组化检测的特异性，选用mortalin强阳性染色的切片，以PBS代替 I 抗的染色结果作为阴性对照。以着色强度及着色细胞数综合计算作为mortalin阳性染色评分标准。按阳性细胞染色强度计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按着色阳性细胞数计分：0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；染色强度与着色细胞数得分相乘，0～1分为阴性(-)，2～4分为弱阳性(+)，5～7分为中度阳性(++)，≥8分为强阳性(+++)。

4 统计学处理

采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5.0统计学软件进行分析。采用2检验或Fisher精确检验法进行临床病理分析；计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示,两独立样本间均数的比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 mortalin在SiHa细胞中的定位

免疫荧光结果显示mortalin主要表达于SiHa细胞的细胞质中，见图1。

Figure 1. The mortalin was mainly located in the cytoplasm of SiHa cells.
图1 mortalin在宫颈癌SiHa细胞系中的胞质定位

2 mortalin在宫颈鳞癌组织中过表达

免疫组化染色显示，mortalin在子宫颈鳞癌组织中过表达,mortalin在子宫颈鳞癌组织中表达的阳性率和强阳性率分别为89.2%(83/93)和62.4%(58/93)，显著高于其在正常宫颈上皮组织中的表达(23.7%和5.1%，P<0.01)，见图2、表1。

Figure 2. The protein expression of mortalin in cervical squamous-cell carcinoma tissues.
图2 mortalin在正常宫颈组织和宫颈鳞癌组织中的表达

表1 mortalin在各组宫颈组织中的表达Table 1. Mortalin protein expression in cervical squamous-cell carcinoma tissues

**P<0.01vsnormal cervical epithelium.

3 mortalin表达与子宫颈鳞癌组织学分级、临床分期及淋巴结转移相关

对mortalin表达与子宫颈鳞癌患者临床病理特征的关系进行分析，结果显示mortalin表达与子宫颈癌组织学分级、临床分期及淋巴结转移密切相关，但与患者年龄和肿瘤大小无明显相关性，见表2。

表2 mortalin表达与宫颈鳞癌临床病理参数之间的关系Table 2. Correlation between mortalin expression and the clinicopathological features of cervical squamous cell carcinoma

4 mortalin表达下调通过EMT途径抑制SiHa细胞的迁移

MTT实验筛选mortalin抑制剂MKT-077作用的最佳浓度及时间为11.93 μmol/L和48 h，见图3A，并通过Western blot实验验证在使用抑制剂后，mortalin的表达水平明显下调(P<0.01),见图3B。细胞划痕及迁移实验结果显示，当mortalin受到抑制时，SiHa细胞的迁移能力显著下降，见图3C、D；进一步通过Western blot检测EMT相关蛋白的表达水平，结果显示抑制mortalin后，上皮表型标志物E-cadhe-rin的表达明显上调，间充质表型标志物vimentin及Snail的表达明显下调(P<0.01),见图3B。

Figure 3. Inhibition of mortalin attenuated the migration ability of SiHa cells. A: the optimal concentration and dosing time of MKT-077 were evaluated by MTT assay; B: the protein expression of EMT-related molecules was determined by Western blot; C and D: the migration ability of SiHa cells was detected by wound-healing (×40) and Transwell migration (×200) assays. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.
图3 抑制mortalin对SiHa细胞迁移能力的影响

讨 论

子宫颈癌是妇科三大恶性肿瘤之一，其中最常见的是子宫颈鳞癌，其发生和发展是一个复杂而多变的过程[8]。随着医学研究的不断进步，诊断子宫颈癌的肿瘤标记物日益增多，主要包括CA125、p53、p16和Ki-67等，在其早期诊断、疗效评估以及判断预后等方面已具有一定的临床意义[9]。近年来针对子宫颈癌治疗靶点的研究多围绕血管内皮生长因子、表皮生长因子受体及基质金属蛋白酶等方面，但靶向治疗仍处于初步阶段，仍存在一些不足，如抗体的异质性、患者耐药性及药物引起的毒性反应等[10]。目前宫颈癌的早期诊断、进展期治疗及预后仍不乐观，因此，研究宫颈癌的潜在分子机制及寻求更有效的分子治疗靶点对于宫颈癌患者的治疗及预后至关重要。

mortalin属于分子伴侣HSP70家族的一员，是人类HSPA9基因编码的蛋白，其基因定位于染色体5q31.1上[11]。mortalin具有蛋白质修饰、免疫应答、参与胞内运输和受体的内化等功能[12]。越来越多的研究表明，mortalin与肿瘤的进展密切相关。Yi等[13]报道,mortalin在肝癌组织中表达上调，并与患者的临床分期及静脉浸润密切相关；Dundas等[7]发现,mortalin在结直肠癌中高表达，并与患者预后不良关系密切。有研究表明,mortalin可能与成纤维细胞生长因子、细胞浆J蛋白等相关，促进肿瘤细胞的增殖能力[14]；Iosefson等[15]研究证实,mortalin的衍生物通过促使p53的功能失活，使肿瘤细胞具有更强的增殖活性、迁移和转移能力及在体内外形成肿瘤的能力；Hu等[16]在研究中发现mortalin蛋白可通过激活MAPK-ERK通路促进肿瘤的发生形成。上述研究提示mortalin的异位表达可能参与肿瘤的发生、发展过程。

本课题组前期研究发现，mortalin在乳腺癌组织中过表达，且与乳腺癌组织学分级、患者临床分期、淋巴结转移密切相关[17]；并发现其在胰腺导管腺癌组织中高表达且与胰腺导管腺癌患者临床分期、神经周围浸润及淋巴转移显著相关[18]。在本研究中，免疫荧光染色法明确了mortalin在子宫颈鳞癌SiHa细胞中主要表达于细胞质，且免疫组化染色结果显示其在子宫颈鳞癌组织中的表达水平显著高于正常宫颈上皮组织。进一步分析mortalin高表达与宫颈癌临床病理特征之间的关系，发现mortalin在晚期(Ⅲ～Ⅳ期)子宫颈鳞癌组织中的强阳性率(83.3%)显著高于早期(0～II期)组织(52.4%，P=0.004)；在发生淋巴结转移患者的子宫颈鳞癌组织中，mortalin表达强阳性率(80.8%)明显高于无淋巴结转移的组织(55.2%)，提示其与子宫颈鳞癌的转移密切相关。Kang等[19]发现,mortalin促进了肝内胆管癌细胞EMT的发生;Na等[20]研究表明mortalin能够促进EMT及肿瘤转移。为进一步探究mortalin在子宫颈鳞癌转移进展中的作用机制，本研究进行了细胞划痕及迁移实验，结果显示抑制mortalin后，SiHa细胞的转移能力明显下降；检测EMT相关蛋白表达水平后发现上皮表型标志物E-cadherin表达明显上调，而间充质表型标志物vimentin及Snail表达明显下调。上述结果与本课题组前期对于mortalin调控浆液性卵巢癌转移及EMT进程的研究结果相符[21]，提示mortalin可能通过EMT途径促进了子宫颈鳞癌的转移。

综上所述，mortalin在子宫颈鳞癌组织中表达明显上调，结合mortalin表达与子宫颈鳞癌临床病理学特征及转移之间的关系，提示mortalin蛋白可能参与子宫颈鳞癌的演进。本研究对于判断子宫颈鳞癌的进展及预后具有重要的临床价值。