miR-24-3p靶向KLF6基因调控IL-6/STAT3信号通路影响食管癌细胞的活力和凋亡*

张 倬，熊 飞，陈天佑，李雪曼，张 程，刘 冲

(武汉市第三医院胸外科， 湖北 武汉 430060)

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一类高度保守的非编码小分子RNA，长度为18～25个核苷酸，广泛存在于生物体内。miRNA可特异性识别靶基因mRNA的3′UTR，并能够与其结合，降解mRNA或抑制mRNA翻译，在肿瘤的发生发展中发挥关键调控作用[1]。研究显示，miR-24-3p在食管鳞状细胞癌组织和癌细胞ECA-109中表达上调，参与食管鳞癌的发生发展[2]。miR-24在食管鳞状细胞癌患者血清中表达上调，其表达水平与放疗敏感性密切相关[3]。生物信息学显示，miR-24-3p可靶向调控Kruppel样因子6(Kruppel-like factor 6，KLF6)表达。KLF6是KLF家族基因编码蛋白质的转录调控因子，在多种肿瘤组织或细胞中表达下调，其表达水平与肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等密切相关[4]。研究显示，KLF6在口腔癌组织中表达下调，其低表达的患者预后较差，KLF6过表达可抑制口腔癌SAS细胞的迁移和侵袭[5]。目前，miR-24-3p和KLF6对食管癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制的研究还很少见。本研究主要探讨了下调miR-24-3p表达以及敲减KLF6表达对食管癌细胞的活力和凋亡的影响，并证实miR-24-3p在食管癌细胞中与KLF6的靶向调控关系，分析miR-24-3p作用的分子机制，以期为食管癌的治疗提供新靶点。

材 料 和 方 法

1 细胞和实验试剂

食管癌细胞TE11购自南京安研生物科技有限公司；食管癌细胞Eca109和EC9706细胞由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠；人正常食管上皮细胞株HEEC购自广州吉妮欧生物科技有限公司。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和RPMI-1640培养基购自Gibco；四甲基偶氮唑盐(MTT)和二甲基亚砜购自Sigma；LipofectamineTM2000试剂盒购自上海瓦兰生物科技有限公司；TRIzol试剂购自Invitrogen；逆转录试剂盒和PCR试剂盒购自MBI；引物序列由上海生工生物有限公司设计提供；miRNA mimics及抑制剂购自吉玛公司；抗细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-depen-dent kinases 4, CDK4)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和细胞分裂周期蛋白25A(cell division cycle protein 25A, CDC25A)抗体购自北京中山生物技术有限公司；抗caspase-3、Bax和Bcl-2抗体购自Abcam；抗信号转导子与转录激活子3(signal transducer and activator of transcription, STAT3)、p-STAT3抗体购自Santa Cruz；Annexin V/PI试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

2 实验方法

2.1细胞培养 复苏食管癌TE11、Eca109和EC9706细胞以及人正常食管上皮HEEC细胞，加入含10% FBS的RPMI-1640培养基，置于37 ℃、5% CO2、97%湿度的培养箱中培养。待细胞融合至80%左右时，胰酶消化，进行后续实验。调整细胞浓度为1×108/L，接种于6孔板中，每孔1 mL。培养24 h后收集细胞，RT-qPCR检测细胞中miR-24-3p和KLF6 mRNA的表达，Western blot检测KLF6蛋白的表达。

2.2细胞转染 EC9706细胞接种到6孔板中，融合至60%时，参照LipofectamineTM2000试剂盒操作说明转染。细胞转染首先分为4组，EC9706细胞转染miR-control、miR-24-3p mimics、anti-miR-control和anti-miR-24-3p；然后再增加KLF6低表达转染组，分为anti-miR-control+si-control和anti-miR-control+si-KLF6两组。转染6 h后，更换新鲜的含10% FBS的RPMI-1640培养液，继续培养至48 h。分别收集各组细胞培养上清液和细胞用于后续实验。

2.3RT-qPCR检测细胞中miR-24-3p和KLF6 mRNA的水平 收集各组细胞，加入TRIzol试剂提取总RNA。参照逆转录试剂盒操作说明，将RNA逆转录后进行PCR扩增。miR-24-3p的上游引物序列为5′-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3′，下游引物序列为5′-ACCGAGUCAAGUCGUCCUUGUC-3′；KLF6的上游引物序列为5′-TGCTACTTGAAAGCACGCCA-3′，下游引物序列为5′-CAGCCTTGCCTTGACCATCT-3′；U6的上游引物序列为5′-CTGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；β-actin的上游引物序列为5′-ATTGCCGACAGGATGCAGA-3′，下游引物序列为5′ -GAGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3′。扩增条件为:95 ℃ 3 min；95 ℃15 s、60 ℃ 30 s，共进行40个循环。miR-24-3p以U6为内参照，KLF6以β-actin为内参照，采用 2-ΔΔCt法计算miR-24-3p和KLF6 mRNA的相对表达水平。

2.4Western blot检测蛋白表达 取各组细胞，加入RIPA蛋白裂解液置于冰上充分裂解，4 ℃、12 000 r/min离心10 min。取上清液，BCA法对蛋白进行定量。取适量蛋白质，进行SDS-PAGE。电泳后，将分离的蛋白电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭2 h。加入 I 抗，4 ℃摇床孵育过夜。TBST漂洗后，加入 II 抗，室温条件反应2 h。TBST漂洗后，加入ECL避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。ImageJ软件分析蛋白条带灰度值。

2.5双萤光素酶报告基因实验 EC9706细胞以每孔1×105个接种到24孔板中，细胞融合至60%时进行转染。分别向EC9706细胞中转染miR-control和miR-24-3p mimics。48 h后，将0.2 μg KLF6-3′UTR-WT或KLF6-3′UTR-MUT与 0.02 μg质粒共转染至每孔细胞中，培养箱中培养12 h后，更换新鲜的含10% FBS的RPMI-1640培养液，继续培养至48 h。PBS洗涤细胞3次后，弃尽洗液，每孔中加入200 μL细胞裂解液，振荡裂解细胞 15 min，4 ℃、1 000 r/min离心5 min，吸出上清液，加入至空白不透明的96孔板中。参照双萤光素酶活性检测试剂盒说明书，检测并计算相对萤光素酶活性。

2.6MTT检测细胞活力 对数期生长的EC9706细胞，胰酶消化，调整细胞浓度为1×107/L，接种于96孔板中，每孔200 μL。接种12 h后，常规转染。转染后分别再培养24 h、48 h和72 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，培养箱中继续培养4 h。吸弃上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，孵育10 min，混合均匀，于酶标仪490 nm处测定吸光度(A)值。

2.7流式细胞术检测细胞凋亡 转染48 h后的各组细胞，胰酶消化制成单细胞悬液，4 ℃、1 000 r/min离心5 min，吸弃上清液，PBS洗涤2次，调整细胞浓度为1×109/L。参照Annexin V/PI试剂盒操作说明书进行染色，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。每组细胞重复检测3次。

2.8ELISA检测IL-6水平 取收集的细胞培养上清液，参照IL-6 ELISA检测试剂盒操作说明，检测上清液中IL-6的表达水平。

3 统计学处理

SPSS 22.0软件分析实验数据。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 食管癌细胞和正常食管上皮细胞中miR-24-3p和KLF6的差异表达

与HEEC细胞比，食管癌TE11、Eca109和EC9706细胞中miR-24-3p的表达显著上调(P<0.05)，KLF6 mRNA和蛋白表达显著下调(P<0.05)，表明食管癌细胞中miR-24-3p呈高表达，KLF6呈低表达。本实验选择EC9706细胞用于后续实验。见图1。

Figure 1. The expression of miR-24-3p (A) and KLF6 mRNA (B) and protein (C) in esophageal cancer cells and normal esophageal epithelial cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHEEC cells.
图1 食管癌细胞和正常食管上皮细胞中miR-24-3p和KLF6的表达

2 miR-24-3p靶向负调控KLF6的表达

TargetScan靶基因测序工具显示，KLF6的3′UTR中含有与miR-24-3p互补的核苷酸序列，见图2A。为了证实miR-24-3p靶向调控KLF6表达，构建KLF6野生型及突变型质粒进行双萤光素酶报告基因实验，结果显示与miR-control组相比，转染miR-24-3p mimics的WT组EC9706细胞的萤光素酶活性显著降低(P<0.05)，而较转染miR-24-3p mimics的MUT组EC9706细胞的萤光素酶活性无显著性改变(P>0.05)，说明miR-24-3p在EC9706细胞中靶向调控KLF6表达，见图2B。Western blot检测结果显示，转染miR-24-3p mimics组的KLF6蛋白水平显著低于miR-control组(P<0.05)，转染anti-miR-24-3p组的KLF6蛋白水平显著高于anti-miR-control组(P<0.05)，进一步说明miR-24-3p在EC9706细胞中靶向负调控KLF6的表达，见图2C。

Figure 2. miR-24-3p has complementary sequences with KLF6 3′UTR and regulates the expression of KLF6 proteins. A:targeting sequence information of miR-24-3p and KLF6 3′ UTR; B: detection of double luciferase activity; C: the protein expression of KLF6. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-control group;#P<0.05vsanti-miR-control group.
图2 miR-24-3p靶向调控KLF6的表达

3 miR-24-3p和KLF6表达对EC9706细胞活力的影响

RT-qPCR检测结果显示，anti-miR-24-3p组EC9706细胞的miR-24-3p表达水平显著低于anti-miR-control组(P<0.05)，说明miR-24-3p低表达的EC9706细胞构建成功，见图3A。MTT检测结果显示，培养72 h时，anti-miR-24-3p组EC9706细胞的A值显著低于anti-miR-control组(P<0.05)，说明敲减miR-24-3p表达可抑制EC9706细胞的活力。Western blot检测结果显示，与anti-miR-control组相比，anti-miR-24-3p组EC9706细胞中的CDK4、cyclin D1和CDC25A蛋白水平均显著降低(P<0.05)，说明下调miR-24-3p表达可抑制与EC9706细胞增殖相关的蛋白表达。分别将anti-miR-24-3p与si-control和si-KLF6共转染至EC9706细胞，结果显示，与anti-miR-24-3p+si-control组比，anti-miR-24-3p+si-KLF6组的miR-24-3p表达、培养72 h时细胞A值以及CDK4、cyclin D1和CDC25A蛋白水平均显著升高(P<0.05)，说明敲减KLF6表达可逆转下调miR-24-3p表达对EC9706细胞活力的抑制作用，见图3。

Figure 3. Knockdown ofKLF6expression reversed the inhibitory effect of down-regulation of miR-24-3p expression on EC9706 cell proliferation.A:effect of transfection of anti-miR-24-3p and si-KLF6 on the expression of miR-24-3p in EC9706 cells;B:effects of miR-24-3p and KLF6 on the viability of EC9706 cells; C:effect of miR-24-3p and KLF6 on the expression of CDK4, cyclin D1 and CDC25A.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsanti-miR-control group;#P<0.05vsanti-miR-24-3p+si-control group.
图3 敲减KLF6表达逆转下调miR-24-3p表达对EC9706细胞活力的抑制作用

4 miR-24-3p和KLF6表达对EC9706细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，anti-miR-24-3p组EC9706细胞凋亡率显著高于anti-miR-control组(P<0.05)，说明敲减miR-24-3p表达可促进EC9706细胞凋亡，见图4A。Western blot检测结果显示，与anti-miR-control组比，anti-miR-24-3p组EC9706细胞中caspase-3和Bax蛋白水平显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05)，说明下调miR-24-3p表达可促进EC9706细胞caspase-3和Bax蛋白表达，抑制Bcl-2表达，见图4B。分别将anti-miR-24-3p与si-control和si-KLF6共转染至EC9706细胞，结果显示，与anti-miR-24-3p+si-control组比，anti-miR-24-3p+si-KLF6组细胞的凋亡率显著降低(P<0.05)，caspase-3和Bax蛋白水平显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05)，说明沉默KLF6可逆转下调miR-24-3p表达对EC9706细胞凋亡的促进作用，见图4。

Figure 4. Knockdown ofKLF6expression reversed the effect of miR-24-3p inhibitor on apoptosis of EC9706 cells. A:the effects of miR-24-3p and KLF6 on apoptosis of EC9076 cells:B:the effects of miR-24-3p and KLF6 on the expression of caspase-3, Bax and Bcl-2. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsanti-miR-control group;#P<0.05vsanti-miR-24-3p+si-control group.
图4 敲减KLF6表达恢复miR-24-3p抑制物对EC9706细胞凋亡的促进作用

5 miR-24-3p和KLF6表达对EC9706细胞IL-6/STAT3信号通路的影响

ELISA和Western blot检测结果显示，与anti-miR-control组比，anti-miR-24-3p组EC9706细胞的IL-6水平和p-STAT3蛋白水平均显著降低；而与anti-miR-24-3p+si-control组比，anti-miR-24-3p+si-KLF6组细胞的IL-6水平和p-STAT3的蛋白水平均显著升高(P<0.05)，说明miR-24-3p调控KLF6表达可影响EC9706细胞IL-6/STAT3信号通路，见图5。

Figure 5. miR-24-3p affected IL-6/STAT3 signaling pathway in EC9706 cells by regulating KLF6 expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsanti-miR-control group;#P<0.05vsanti-miR-24-3p+si-control group.
图5 miR-24-3p调控KLF6表达影响EC9706细胞IL-6/STAT3信号通路

讨 论

食管癌是世界范围内严重威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤，具有较高的发病率和死亡率[6]。食管癌患者的恶性程度高，多数患者确诊时已处于晚期，预后较差[7]。由于医学水平的进步，患者预后有了较大改善，但5年生存率依然较低[8]。近年来研究表明，miRNA与食管癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等密切相关[9-10]，参与食管癌的发生发展，探讨miRNA对食管癌细胞生物学特性的影响，对其诊断和治疗以及患者预后有重要意义。

miR-24-3p是miR-24的亚型之一，在多种肿瘤中表达异常，参与肿瘤的发生和发展。研究显示，miR-24-3p在膀胱癌组织中表达升高，其高表达可促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制细胞凋亡，是膀胱癌治疗的潜在靶点[11]。miR-24-3p通过直接靶向SOX7促进肺癌细胞的增殖和迁移[12]。目前，miR-24-3p对食管癌细胞增殖和凋亡的研究还未见报道。本研究结果显示，食管癌TE11、Eca109和EC9706细胞中miR-24-3p表达显著上调，转染anti-miR-24-3p的EC9706细胞A值显著降低，细胞凋亡率升高，说明下调miR-24-3p表达可抑制EC9706细胞活力，诱导其凋亡，提示miR-24-3p在食管癌的发生发展过程中起重要调控作用，可能是食管癌治疗的潜在靶点。细胞增殖依赖于细胞周期的顺利进行，细胞周期与细胞周期调控蛋白和依赖性激酶的正常表达密切相关。Cyclin D1是细胞周期G1期的关键调控蛋白，其含量及活化程度可限制细胞周期中G1/S期的转换过程[13]。细胞周期依赖性激酶4是G1期的的重要调控分子，正向调控细胞周期，其高表达促进恶性肿瘤的恶化进程[14]。CDC25A促进G1向S期及G2向M期过渡，其表达异常可导致细胞周期紊乱，促进肿瘤细胞增殖[15]。本研究结果显示，下调miR-24-3p表达可抑制EC9706细胞中cyclin D1、CDK4和CDC25A蛋白表达，提示miR-24-3p可能通过调控与细胞周期相关蛋白的表达进而抑制EC9706细胞活力。Caspase-3、Bax和Bcl-2 蛋白与细胞的凋亡密切相关。本研究结果显示，下调miR-24-3p表达可促进Caspase-3和Bax蛋白表达，抑制Bcl-2蛋白表达，提示miR-24-3p通过影响与凋亡相关的蛋白诱导食管癌细胞凋亡。

TargetScan靶基因测序工具显示，KLF6的3′UTR中含有与miR-24-3p互补的核苷酸序列，miR-24-3p可能调控KLF6表达。本研究结果显示，食管癌细胞中KLF6 mRNA和蛋白表达水平降低，与相关研究报道结果一致[16]，提示KLF6 作为抑癌基因参与食管癌的发展进程。为了进一步探讨miR-24-3p调控食管癌细胞增殖和凋亡的分子机制，本研究采用双萤光素酶报告基因实验证实了miR-24-3p在EC9706细胞中靶向负调控KLF6表达。

IL-6/STAT3信号通路是肿瘤细胞增殖和凋亡关系密切的信号传导通路之一[17]。IL-6是一种多效能的细胞因子，其通过结合可溶性IL-6受体形成IL-6/sIL-6R复合物，进而活化细胞膜表面的gpl30，激活并维持STAT3的磷酸化水平[18]。STAT3是STATs家族的重要成员之一，在免疫细胞和肿瘤细胞中起关键作用[19]。STAT3的异常活化与肿瘤的发生密切相关。STAT3被激活后调控相关关键基因的表达，促进细胞增殖、迁移和侵袭、抗细胞凋亡等，进而表现出致癌作用[20]。本研究结果显示，下调miR-24-3p表达可降低EC9706细胞IL-6水平以及p-STAT3蛋白水平，提示miR-24-3p可调控IL-6/STAT3信号通路；而沉默KLF6能够消除下调miR-24-3p表达对EC9706细胞IL-6及p-STAT3表达的抑制作用，提示miR-24-3p可能通过靶向调控KLF6抑制IL-6/STAT3信号通路参与EC9706细胞的生长和凋亡。

综上所述，食管癌细胞中miR-24-3p呈高表达，KLF6呈低表达。下调miR-24-3p表达可抑制食管癌细胞的生长，诱导其凋亡，而沉默KLF6可抑制miR-24-3p低表达对食管细胞的活力和凋亡的影响，其机制可能与影响IL-6/STAT3信号通路有关。