基于TCGA和Oncomine数据库前列腺癌关键基因的筛选

瞿根义 向茂林 徐勇 阳光 王佳威 汤乘

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是泌尿外科常见的恶性肿瘤[1]。近年来我国PCa发病率呈逐年上升趋势，目前在泌尿系肿瘤中居第二位[2]。PCa患者易发生骨转移，转移后5年生存率低于29%，而且经过内分泌治疗后，大部分患者最终会发展为去势抵抗性PCa[3]。因此，深入研究PCa发生、发展的机制，具有重要的临床意义。生物信息学是将计算机技术和分子生物学相结合的技术，为基因的研究提供了方法。癌症和肿瘤基因图谱（cancer genome atlas，TCGA）和Oncomine数据库是大型肿瘤基因芯片数据库，具有大样本和丰富的临床数据。本研究利用TCGA和Oncomine数据库深入挖掘PCa差异表达基因，然后进行基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，建立蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，并筛选Hub基因，最后通过Meta分析筛选影响PCa发生、发展的关键基因。

1 资料和方法

1.1 资料来源 通过TCGA数据库（https://cancergenome.nih.gov/）下载公开的PCa RNA测序数据，包括PCa组织499例，癌旁正常组织52例。

1.2 差异表达基因的获取 采用R 3.5.3软件的edgeR软件包对数据进行标准化及差异表达分析，筛选logFC绝对值＞1.5，FDR＜0.05的基因为差异表达基因。采用ggplot2软件包对数据进行图形可视化。

1.3 差异表达基因的GO和KEGG通路分析 通过DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov）对差异表达基因进行GO和KEGG通路分析，P＜0.05为差异有统计学意义；其中GO分析包括生物学过程（biological process，BP）、细胞组成（cell composition，CC）和分子功能（molecular function，MF）。采用R 3.5.3软件及相应的cluster Profiler包进行注释和可视化。

1.4 差异表达基因的PPI网络分析 通过STRING数据库（https://string-db.org/）对差异表达基因进行分析并构建PPI网络[4]。采用 Cytoscape软件中的Cytohubba筛选PPI网络中连接程度前10位Hub基因。

1.5 Hub基因与PCa相关数据的获取和Meta分析 通过Oncomine数据库（https://www.oncomine.org）获取Hub基因与 PCa 相关数据，检索条件：（1）基因：Hub；（2）分析类型：癌组织与正常组织的比较分析；（3）肿瘤类型：PCa；（4）阈值：P＜0.0001，倍数变化＞2，基因排序为排名前10%。采用Meta分析获取的Hub基因与PCa相关数据，得出关键基因。

2 结果

2.1 PCa差异表达基因的筛选结果 最终筛选出PCa差异表达基因919个，其中表达上调基因424个，表达下调基因495个，火山图见图1（插页）；差异最显著的前50个基因热图见图2（插页）。

2.2 差异表达基因的GO和KEGG通路分析结果 GO分析显示，差异表达基因BP中主要富集于突触传递、细胞间信号传导、跨膜转运和细胞分化，CC中主要富集于细胞外空间、细胞外区域、质膜的组成部分和质膜，MF中主要富集于序列特异性DNA结合、钙离子结合和结构分子活性，见表1和图3（插页）。KEGG通路分析显示，差异表达基因主要富集于神经活性配体-受体相互作用、药物代谢-细胞色素P450和细胞色素P450代谢异种生物，见表2和图4（插页）。

2.3 差异表达基因的PPI网络分析结果 构建的PPI网络中，差异表达基因919个，其中表达上调基因424个，表达下调基因495个。连接程度前10位Hub基因分别是 CDC20、CCNA2、BUB1B、HJURP、AURKB、TTK、KIF4A、MKI67、CENPA、NCAPH，见图 5（插页）。

2.4 Hub基因与PCa相关数据的Meta分析结果 最终获得4个关键基因，分别是HJURP、KIF4A、CENPA、NCAPH，Meta分析结果见图6（插页）。

图1 前列腺癌（PCa）与癌旁正常组织差异表达基因的火山图（红点所示为上调基因，绿点所示为下调基因，黑点所示为无显著差异的基因）

图2 前列腺癌（PCa）与癌旁正常组织差异表达最显著的前50个基因热图

图3 PCa差异表达基因GO分析的可视化图（PCa为前列腺癌，GO为基因本体论）

图4 PCa差异表达基因KEGG通路分析的可视化图（PCa为前列腺癌，KEGG为京都基因与基因组百科全书）

图5 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络中连接程度前10位Hub基因

图 6 关键基因在前列腺癌（PCa）组织中表达的 Meta分析结果（a：HJURP；b：KIF4A；c：CENPA；d：NCAPH）

3 讨论

随着我国人口老年化的加剧，PCa发病率明显升高。PCa的生物学特性是骨转移，一旦发生转移，PCa患者的生活质量及生存预后均会受到较大影响[5]。因此，深入挖掘PCa发生、发展的关键基因具有重要的临床意义。

TCGA是由美国癌症研究所和美国人类基因组研究所在2006年共同发起的项目，主要利用高通量测序技术建成的一个综合的、多维的癌症地图，以提高对癌症的发生、诊断和治疗的理解，以及对癌症发病机制的认识[6]。本研究从TCGA数据库下载PCa RNA测序数据，利用生物信息学技术挖掘出PCa差异表达基因919个，其中表达上调基因424个，表达下调基因495个。然后采用DAVID数据库对差异表达基因进行富集分析，GO分析显示BP中差异表达基因主要富集于突触传递、细胞间信号传导、跨膜转运和细胞分化，CC中主要富集于细胞外空间、细胞外区域、质膜的组成部分和质膜，MF中主要富集于序列特异性DNA结合、钙离子结合和结构分子活性；而KEGG通路分析显示，差异表达基因主要富集于神经活性配体-受体相互作用、药物代谢-细胞色素P450和细胞色素P450代谢异种生物。进一步利用STRING数据库构建PPI网络，连接程度前10位Hub基因分别是CDC20、CCNA2、BUB1B、HJURP、AURKB、TTK、KIF4A、MKI67、CENPA、NCAPH。最后采用Oncomine数据库筛选出PCa关键基因4个，分别是HJURP、KIF4A、CENPA、NCAPH。

表1 PCa差异表达基因GO分析结果

表2 PCa差异表达基因KEGG通路分析结果

HJURP是一种蛋白质编码基因，作为CENPA的伴侣蛋白，在G1早期介导CENPA与着丝粒的组装，从而使得细胞分裂过程中的染色体以高保真分离[7]。CENPA为着丝粒蛋白A，在细胞分裂中也起着至关重要的作用。研究表明，CENPA表达升高与多种癌症的发展有关[8]。PCa相关研究表明，HJURP出现显著高表达，且与生存预后相关，可作为PCa生化复发及生存预后的潜在标志物[9]。KIF4A位于人类染色体Xq13.1，参与染色体的浓缩与分离，是有丝分裂胞质分裂和后期纺锤体动力学的关键调控因素，同时对细胞有丝分裂和DNA损伤修复发挥着关键的调控作用，与肿瘤的发生、发展也密切相关[10]。同样，PCa相关研究显示，KIF4A出现异常高表达，且与生存预后显著相关[11]。另有研究发现，KIF4A表达与雄激素受体水平呈正相关，在PCa患者中KIF4A与雄激素受体形成自动调节的正反馈，并通过下调KIF4A的表达来改善恩杂鲁胺的耐药性，同时增强去势抵抗性PCa细胞对内分泌治疗的敏感性[12]。NCAPH通过调节拓扑异构酶Ⅱ的活性和染色体的分离，从而在细胞有丝分裂过程中发挥重要的调控作用。研究表明，NCAPH通过上皮间质转化机制来影响肿瘤细胞的迁移与侵袭[13]。PCa相关研究显示，NCAPH同样出现显著高表达，且与去势抵抗性PCa的发生密切相关，与PCa发展为去势抵抗性PCa的时间有关，可作为去势抵抗性PCa患者生存预后的标志物[14]，但具体机制目前尚未阐明。笔者认为对Hub基因和关键基因作进一步研究，将会为PCa发生、发展的机制挖掘更多新的发现。

综上所述，本研究基于TCGA和Oncomine数据库获取PCa关键基因4个，包括HJURP、KIF4A、CENPA、NCAPH。但仍需要深入研究，进一步阐明这些基因在PCa发生、发展机制中的具体生物学功能，为PCa治疗提供新的线索和方向。