浓香型白酒地域性及窖泥微生物研究进展

梁 欢，许长峰，朱立宁，唐伟斌

（1.邢台学院 生物科学与工程学院，河北 邢台 054001；2.河北经贸大学 生物科学与工程学院，河北 石家庄 050200；3.河北凤来仪酒业有限公司，河北 宁晋 055550）

作为世界六大蒸馏酒之一，中国白酒以其独一无二的风味著称于世。其酿造的原料、工艺和环境的差异，造就了众多的白酒香型。十二种常见香型中，浓香型凭借着超过七成的消费量和最广阔的生产分布区域而成为了白酒中的佼佼者。泥窖发酵是浓香型白酒的基础工艺，窖泥上多年富集的微生物种群产生了酒体的呈香物质。各地生产的浓香型白酒虽然工艺相近，但香味风格存异，皆因菌群使然。众多浓香型白酒酿造企业的生存和发展与质量和特色休戚相关。地域性是与生俱来、无法复制的优势。本文总结浓香型白酒风味特征的地域划分，综述窖泥品质、窖泥微生物研究现状，以期为厘清菌群地域差别、培植地方小众浓香型白酒的乡土优势、振兴北方浓香型白酒提供参考。

1 浓香型白酒的地域性

与酱香型白酒茅台的“一枝独秀”相比，以五粮液、泸州老窖、剑南春、洋河、古井等品牌为代表的浓香型白酒则可谓是“四处开花”。由于浓香型白酒具有香气浓郁、醇甜浓厚、协调净爽而深得民心，市场需求巨量，各地均有酿造生产。1992年，沈怡方[1]首提“四川”和“苏、皖、鲁、豫”两个地域所产浓香型白酒的风味区别，并上升到流派高度。范广璞等[2]论证了原料、工艺和地理环境不同导致主要微量香味成分差异，最终体现在酒体的特征上，将产于四川区域的浓香型白酒定义为“川派”，产于苏鲁皖豫地区的定义为“秦淮派”。李维青[3]认为不同地域的生态环境引发酿酒微生物区系不同，加之原辅料、工艺技术水平不同，所产浓香白酒风格存在微妙或较为明显差异，明确指出浓香型白酒具有明显的地域性，并进一步将浓香型白酒按生产地域分为“川、冀、江淮（黄淮）、北方……”。程伟等[4]划分了白酒以流域为纽带所形成的聚集产区，研究了江淮地区自然环境对柔和型白酒品质的影响，明确了其地域优势。于春涛等[5]研究证明浓香型白酒窖泥中细菌多样性与其产区之间存在一定联系。

大量研究表明，浓香型白酒具有明显的地域性，正所谓“一方水土酿一方酒”。三分天下之论与所对应的群山合围的四川盆地、蜿蜒起伏的秦淮丘陵山岗、地势平坦的北方平原地带，以及泾渭分明的气候、生态环境特征相吻合。虽然地域差异决定的原料、气候环境、菌群资源的各异，又导致浓香型白酒酒体风味的奇妙迥异，目前的地域性研究却有着粗犷、简单之嫌。

2 浓香型白酒酿酒窖泥质量的研究

泥窖实为浓香型白酒的魂魄。泥窖发酵是浓香白酒最重要的工艺环节之一。浓香型白酒香味形成与窖池息息相关，窖泥是酒体生香功能微生物的繁殖容器及载体。不同品牌都有自己独有的窖泥来源，这也是浓香白酒地域性的重要表现。五粮液使用宜宾独特的弱酸性黄泥黏土，泸州老窖的窖泥采用泸州附近五渡溪出产的细腻黄黏土，冀酒泥坑采用的则是河北宁晋黑龙港流域独有之狗头胶泥……总的来看，各种浓香酒的窖泥大多为胶黏土，分布于主产区及周边。窖泥的黏性既满足了保水不透气的要求，又达到了附着在窖壁的效果。其原泥不仅含有氮、磷、钾、钙、铁、镁等成分，且随着使用时间的增加，各元素还会在部位、种类、含量等水平发生变化[6]，表现出窖泥的优劣和老熟程度。何宏魁等[7]采用常规分析检测技术测定窖泥pH值和腐殖酸含量，研究其与细菌含量的相关性，推断这两项指标可用于衡量窖泥微生物数量的理化指标。

对窖泥质量的评价研究，主要集中在窖泥对菌群的富集能力和对功能菌的时空筛选驯化。“酒好全凭窖池老”，优质老熟的窖泥对酒质的提高与稳定至关重要[6]。由于不同酒企采用窖泥的独特性，以及生产过程参数控制的不同，导致其理化指标差异较大，需要建立企业级窖泥质量标准和窖泥保养技术规范。

3 浓香型白酒窖泥微生物的研究方法与技术

浓香型白酒酿造过程的实质是分别来自于环境、曲药和窖泥的微生物，在窖池内酒醅中发生的固、液、气三维空间的物质能量代谢过程。窖泥中栖息着极其丰富的微生物区系。窖泥微生物的协同发酵为酒体香味物质的形成和转化提供反应底物，进而奠定了浓香型白酒浓郁复合香气的风味特征基础。

3.1 窖泥微生物研究方法

包括分离、纯化、培养、镜检、理化性质测定等环节在内的传统微生物研究方法，目前依然是研究酿酒窖泥微生物不可或缺的成熟技术，主要用于菌类的种类鉴定。由于自然界中只有0.1%～10%的微生物可以被直接培养[8]，大多数窖泥微生物难以利用传统方法培养和研究。20世纪90年代，源自分子生物学研究领域的变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、催化报告沉积-荧光原位杂交（catalyzed reporter deposition-fluorescence in situ hybridization，CARD-FISH）、磷脂脂肪酸（phosphor lipid fatty acid，PLFA）指纹图谱等技术已经在酿酒微生物研究领域得到广泛应用。这些方法跳过分离培养环节，可通过直接检测样品中细菌总脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）而确定窖泥微生物种类及丰度，避免了传统微生物研究的局限性。近年来一经推出就被快速推广的高通量DNA测序技术——Illumina Solexa 合成测序，凭借对以百万计的原位DNA样品分析产生遗传信息，来同时分析样本内菌群丰度和样本间菌群丰度差异。该技术能深度测序，大规模、高通量、短耗时，尤适分析复杂多菌种样品，在生物、医学、土壤、食品等领域研究中被广泛应用。在酿酒行业，高通量程序技术已经应用于酱香、清香、浓香等香型的窖泥、大曲、酒醅、糙沙微生物群落的研究[9-13]。

3.2 酿酒微生物研究技术的应用

白酒为中国特产。国外对白酒的研究目光主要集中在酿酒菌类的培养技术和分离鉴定技术的改进方面。浓香型白酒发酵中产香己酸菌的研究起始于20世纪40年代。MUYZER G等[14]将DGGE技术应用于微生态学研究领域，证实了此技术在解释生物遗传多样性和种群多样性差异方面的独特优势。迄今为止微生物鉴定系统中最大的数据库资源当属美国MIDI公司20世纪90年代研发出来的Sherlock MIS微生物自动鉴定系统[15]。ENDO A等[16]利用PCR-DGGE法检测到了常规细菌检测方法没有检测出的韩国烧酒酿造过程中含有的乳酸菌群。MADOROBA E等[17]采用DGGE法和常规分离方法对南非高粱自然发酵过程中细菌种群的多样性和动态变化进行了跟踪分析，认为这两种技术的结合使用对揭示微生物的多样性至关重要。FISH和CARDFISH均被用于改进土壤微生物的检测[18]，CARD-FISH相对更适合用于图像分析研究。

国内对浓香型白酒微生物的研究起步晚，但发展迅速。传统的微生物分离分类鉴定技术在筛选、培养菌株[19]研究方面有所长，但揭示酿酒微生物的多样性则为短板。刘茂柯等[20-22]用变性梯度凝胶电泳分析窖泥放线菌和复合功能菌液群落结构，魏娜等[22]的实验证明实时荧光定量PCR技术可用于窖泥微生物区系特定种群的快速定量检测。具有准确地表征、预测微生物群落结构优势的高通量测序技术一经问世即被广泛应用。李俊辉等[23-24]采用高通量测序技术分别分析研究了窖泥样品中微生物与古菌群的群落结构。五粮液[25]、泸州老窖[26]、古井贡[27]、宋河粮液[28]、古襄阳[29]等酒企分别利用高通量测序技术对窖池中窖泥的微生物群落进行了不同程度的解析。而利用传统培养技术与现代高通量测序技术结合方法，韩颖[30]分离鉴定了窖泥中微生物群落，进行了宏基因组测序。

4 窖泥微生物的种类组成与种群结构研究

研究窖泥微生物的种类组成与群落结构，对于揭示白酒酿造风味机理、提质增香具有相当重要的作用。1964年，茅台试点首次发现浓香型白酒主体香气物质是己酸乙酯，并成功地从窖泥中分离出与甲烷短杆菌共栖的鼓槌状芽孢杆菌，经一系列形态观察及生理生化鉴定，确定了所分离的是己酸菌[31]。不完全统计，从窖泥中分离鉴定的酿酒功能菌已近百株。白酒品质与这些微生物复杂的代谢活动及代谢产物息息相关，其中己酸菌的主要代谢产物己酸乙酯是浓香型白酒酒体香味的主体[32]的论断已经成为共识。

综合学者研究结果，窖泥微生物类群包含有细菌、霉菌、酵母菌、古生菌和放线菌等，大多数为细菌和古生菌。细菌从科水平而论，主要由盐扁菌科（Haloplasmatacea）、芽孢杆菌科（Bacillaceae）、球菌科（Planococcaceae）、互营单胞菌科（Synergistaceae）、葡萄球菌科（Staphylococcaceae）、嗜热厌氧菌科（Thermoanaerbacteraceae）、梭菌科（Clostridiaceae）等组成。不同地域的窖泥中古生菌菌落趋于一致，主要由甲烷杆菌纲（Methanobacteria）的甲烷杆菌科（Methanobac teriaceae）和甲烷球菌纲（Methanococci），与热源体纲（Thermoplasmata）的热原体科（Thermoplasmataceae）构成[33-34]。王春艳等[28]比较了浓香型白酒16年窖龄窖泥中细菌群落结构，绝对优势属为梭菌属（Clostridium）、氨基酸杆菌属（Aminobacterium）、理研菌属（Petrimonas）、互营单胞菌属（Syntrophomonas）和消化链球菌属（Sedimentibacter）。刘燕梅等[35]从浓香型白酒窖泥中筛选出对浓香型风味的形成起着放香、助香及调香作用的球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaerieus）、短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）、尘埃类芽孢杆菌（Paenibacillus larvaesubsup.pulvifaciens）。赵辉等[36]对兼性厌氧细菌高产己酸菌进行分离得到3株菌—巨大芽孢杆菌（B.megaterium）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）和梭状芽孢杆菌（B.fusiformis）。黄治国等[37]分离纯化得到5株细菌，分别为微球菌属（Mierococcus）、水稻细菌性古枯病菌属（Burkholderiaglumae）、芽孢杆菌属、葡萄球菌属（Staphylococeus）、假单胞菌属（Pseudomonas）。甚至周艳等[38]对25年窖龄窖泥中的1株产丁酸菌株进行了多相分类学研究，经分析发现该菌可能为毛螺旋菌科的一个新属。张志伟等[39]在窖泥微生物的研究中发现不同年份窖泥中优势菌种差别较大，窖泥不同高度优势菌种也大有不同。罗杰等[40]研究发现，窖池中壁泥和底泥细菌种类及数量的差异性较大，认为其细菌系统发育多样性及相互之间存在差异。李绍亮等[41]研究认为，就总数而言，窖泥中细菌、放线菌、酵母菌和芽孢杆菌随着窖池窖龄的增加而增加，霉菌的变化较小；同窖龄窖泥，池底细菌高于池壁，池壁的放线菌和酵母菌高于池底。窖池所产原酒质量随窖龄的增加明显提升。

5 结论与展望

总结目前浓香型白酒窖泥微生物的研究现状，以下几个特点是显而易见的。一是在窖泥微生物种类数量研究领域，传统的分离培养技术仍在发挥着重要作用。人们热衷于筛选鉴定影响酒体风味的关键菌，并对其分离、培养、扩繁，以功能菌复合菌制剂形式再返施窖泥，进行窖泥的培熟、养护，以及变质窖泥的处理[42]。这一技术还将继续使用并发展改进。但存在的问题是，大型酒企凭借雄厚的实力起步较早，一些中小酒企则相对落后。企业依靠直接从科研院所和大酒企购买功能菌制剂用于生产，易产生水土不服现象，降低效果。二是在窖泥菌群交替演化规律，以及环境、时空变化与菌群性质功能的关系上，随着现代研究技术的应用，规律与关系日渐清晰，从微生态到车间环境，引导、改善酿造体系向着提质降耗方向转移成为了可能。同样，知名酒企大众品牌在这方面也走在前列。从而引出第三个方面，浓香型白酒的地域特性被掩盖，发展不平衡。特别是北派浓香酒，地域广，产区分散，大部分经济不发达，科技支撑度低，使得凭借独特的历史文化、地理气候、工艺技艺而流传继承至今的地方品牌发展举步维艰。

发展浓香型白酒产业，重点在“香”，方向在“特”。在保持目前川派、秦淮派发展势头的前提下，做大做强北派浓香。一方面加强理念引导，凝练特色，借力川派的醇冽、秦淮的绵柔来打造北派的净雅。二是保护遗产与资源，充分利用历史文化和自然资源，天人合一、水土共酿，让辽阔、粗犷和四季融入酒体，突出地域特色。三是科技赋能，摸清底数，采用新技术提质增香降耗，传承提升老工艺，创新酿酒新技艺，让小众酒走向大市场。