自噬在脊髓细胞中的作用与机制研究进展

朱 宁，杨新明，张 瑛

(1.河北北方学院研究生院，河北 张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院骨科，河北 张家口 075000)

脊髓损伤后因运动神经元和感觉神经元被破坏可导致截瘫和四肢瘫痪，是脊柱外科常见的复杂神经系统疾病，全亚洲脊髓损伤平均年患病约为12.1～61.6人次/100万，中国脊髓损伤年患病约为37人次/100万[1]。由于尚无有效的治疗方法，脊髓损伤的致残率及致死率较高。脊髓损伤中多种细胞参与自我修复过程，大致分为3大类：①神经元细胞；②神经胶质细胞，如星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞；③其他细胞，如血管内皮细胞和血源性巨噬细胞[2]。脊髓损伤相关研究多集中在神经元细胞及神经胶质细胞。现综述脊髓损伤后自噬在不同类型细胞中作用机制的研究进展及自噬对受损组织的影响。

1 脊髓损伤病理生理机制

坠落、暴力袭击、车祸、工伤事故等原因可导致脊柱分离错位，脊髓受到压迫或离断，可导致细胞坏死、轴突物理性横断及损伤部位局部血管丢失，该过程被称为原发性损伤。原发性损伤导致炎性细胞如巨噬细胞、小胶质细胞、T细胞和中性粒细胞浸润病变区域，释放出TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6等炎性因子[3]，浸润的巨噬细胞，嗜中性粒细胞和活化的小胶质细胞参与氧化应激反应，促进自由基形成，导致细胞和亚细胞器细胞膜正常磷脂结构过氧化，结构紊乱，加重神经损害[4]。此外，细胞释放谷氨酸产生谷氨酸兴奋性毒性，离子失衡，进一步导致神经细胞死亡[5]。细胞死亡的3种常见类型为细胞凋亡、自噬性细胞死亡和细胞坏死。

2 细胞自噬

自噬是一种细胞自我保护机制，通过自噬体-溶酶体途径降解和再循环胞内物质，如受损细胞器、有毒物质、错误折叠蛋白质等，在维持细胞稳态方面具有重要作用[6-7]。多数细胞中自噬发生在基础水平，但在环境压力、营养缺乏或急性细胞损伤等不利条件下，自噬会被进一步激活，膜结构包绕细胞质成分，包括受损的细胞器和蛋白质，自噬小体形成，自噬小体在细胞内运输并与溶酶体融合，溶酶体水解酶降解自噬体的内膜和自噬体中包含的细胞成分[8]。LC3、Beclin1和p62通常用于监测脊髓损伤中细胞自噬的活性，细胞中存在两种剪切形式的LC3蛋白：LC3I和LC3II，当发生自噬时，LC3I发生类泛素化，并与自噬体液泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)结合，形成与自噬液泡膜结合的LC3II。因此，LC3II的表达或LC3II/LC3I的比率可作为反映自噬泡数目的直接指标[9-10]。此外，自噬前体中需要Beclin1-Vps34-Vps15核心复合物，Beclin1参与自噬前体构成，且Beclin1的表达与自噬体活性密切相关[11]。由于自噬是降解受损细胞器和有害蛋白质的动态机制，因此检测降解标记具有重要意义，例如，p62也称为Sequestosome 1(SQSTM1)，通过与LC3结合掺入自噬体，随后通过自噬降解，因此p62水平可用于评估自噬通量[12]。

2.1 自噬在脊髓损伤后神经元中的作用

神经元是中枢神经系统的基本单位，大多数神经元具有细胞体、轴突和树突。中枢神经系统创伤导致进行性继发性损伤过程包括神经元细胞死亡和轴突损伤，导致神经功能障碍。神经元自噬的变化取决于损伤模型和严重程度。脊髓缺血后，LC3II/LC3I和Beclin1表达的比率均增加，分别在8 h(早期)和72 h(晚期)达到两次峰值，然后缓慢降低至基线[13]。在严重脊髓挫伤模型中，Beclin1和LC3II的表达水平在1 h开始上升，2 h达到峰值，并在24 h逐渐下降至接近正常水平[14]；在小鼠脊髓半切模型中，术后6 h可观察到自噬改变[15]；在脊髓压迫损伤模型中，自噬相关蛋白LC3B及p62表达在脊髓损伤后第1天达到峰值，然后在第7天下降[16]。

通过免疫组织化学法染色观察脊髓背角、前角、背柱和腹侧白质神经元，研究发现损伤后LC3阳性细胞和p62阳性细胞的总数均显著提高。自噬体积累程度与损伤部位接近程度相关。从受伤后第1天开始，在白质中，LC3和p62阳性细胞集中在靠近损伤区域的背侧；在灰质中，LC3和p62阳性细胞优先集中在前角区域，可能原因是自噬通量受损，导致自噬小体在脊髓损伤后积累[17]。同时，自噬受损的运动神经元也表达了更高水平的凋亡相关蛋白caspase 12和cleaved caspase 3，表明与溶酶体损伤诱导的自噬功能障碍可导致脊髓损伤后神经元细胞死亡[16]。

一些学者研究了自噬体在神经元中的运输。在没有饥饿或环境压力的基础条件下，自噬体主要在突触前末端和远端轴突中产生，其膜和蛋白来自内质网而不是胞浆或线粒体[18]。动作电位后，通过胞吐作用将神经递质由突触前膜释放，此时突触囊泡与质膜融合，因此，突触小泡循环可以导致蛋白质和其他膜成分的积累，这些蛋白质和其他膜成分需要通过自噬进行降解和再循环，以维持神经传递的效率并促进突触的可塑性[7]。在神经元中，与非神经元细胞不同，自噬体的形成及其与溶酶体融合后的转运在空间上是分离的，因为自噬体在远端轴突中形成，并沿微管逆行转运至细胞体,与细胞体溶酶体结合[19]。自噬体以依赖于动力蛋白的方式逆行运输至胞体[20-21]，并与溶酶体融合[22]。尽管许多神经退行性疾病与神经元自噬缺陷有关，但神经元自噬体的功能目前未被完全了解。最近的一项研究表明自噬体可将神经营养信号从突触前末端传递至细胞体，例如，包含脑源性神经营养因子(BDNF)整合远端轴突的TrkB/BDNF信号，进而控制BDNF的表达。这些发现突显了突触前末端自噬与BDNF/TrkB信号传导之间的联系[23]。

2.2 自噬在脊髓损伤后少突胶质细胞存活中的作用

少突胶质细胞(oligodendrocyte,OL)是一种神经胶质细胞，主要来源于少突胶质细胞前体细胞(oligodendrocyte progenitor cell，OPC)。OPC特异性表达血小板源性生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptor α，PDGFRα)及神经胶质抗原2(neuron-glia antigen 2，NG2)，分化早期逐渐开始表达O4蛋白；随着分化的进行，逐渐表达O1、GalC及CNPase等蛋白；成熟的OL包裹多个神经轴突形成髓鞘，因此髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表达预示着OL的成熟[24]。OL主要功能是为轴突提供支持和绝缘，使得中枢神经系统的髓鞘细胞在发生脱髓鞘损伤时，具有一定的再生能力。

由于这一复杂的分化程序及其独特的代谢和生理机制，OL属于中枢神经系统中最脆弱的细胞之一。OL在脊髓损伤后会发生凋亡，因此OL的死亡和脱髓鞘作用是继发性损伤的主要病理过程[8]。有研究证明脊髓损伤会引起OL自噬改变，但对OL和OPC自噬的产生机制或功能知之甚少。为研究自噬的作用，在OL选择性敲除Atg5的转基因小鼠建立脊髓挫伤模型中，发现选择性Atg5敲除后的OL自噬通量减少，后肢运动功能恢复显著降低，因此，自噬是OL中必不可少的细胞保护途径[25]。有研究表明Atg5的丧失严重损害了OPC的存活并抑制其向OL分化，分化成熟的OL可表达高水平的自噬标记，且在髓鞘形成过程中发生自噬，因此自噬诱导和抑制可分别促进和抑制髓鞘形成[26]。以上结果表明自噬对少突胶质细胞分化和存活及正常的髓鞘形成至关重要。

2.3 自噬在脊髓损伤后小胶质细胞中的作用

小胶质细胞是遍布整个中枢神经系统的一种神经胶质细胞，可在数小时内被激活并被招募到脊髓病变部位，是中枢神经系统主动免疫防御的主要形式[27]。炎症主要由活化的小胶质细胞/巨噬细胞产生，小胶质细胞/巨噬细胞表型可分为M1表型和M2表型[28]。在脊髓损伤后小胶质细胞主要极化到M1表型，引起神经毒性物质释放，如自由基、炎性细胞因子和趋化因子等，这些炎性介质可加重炎症反应，导致神经元损伤[29]。相反，M2表型能够通过释放IL-4和TGF-β抑制过强的免疫反应，促进神经再生，特别是轴突延伸[30-31]。因此小胶质细胞/巨噬细胞表型及不同表型在中枢神经系统炎症中的不同作用有待深入研究。有研究表明调节AMPK/mTOR途径介导的自噬可激活小胶质细胞/巨噬细胞向M2极化并抑制小胶质细胞/巨噬细胞向M1极化，从而保护神经元细胞免受凋亡[29]。激活自噬可减少CD68阳性标记的活化小胶质细胞数目，促炎因子TNF-α，IL-1β和IL-6减低，抑制炎性因子的分泌来减轻神经炎症[32]。在机制水平上，自噬被认为调节NLRP3炎性小体的活性，减少IL-1B释放的细胞反应[33]。自噬也可限制线粒体损伤和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生，例如siRNA-Beclin 1或siRNA-ATG5转染抑制自噬导致小胶质细胞活化，线粒体ROS大量产生，线粒体膜电位丧失，促炎细胞因子分泌，包括IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α及促进MAPK、NF-κB表达，而雷帕霉素治疗诱导的自噬可以显著抑制小胶质细胞的炎症反应[34]。此外，自噬直接靶向作用RELA/p65蛋白，通过调节NF-κB激活所需的p62调节炎症[35-36]。调节自噬可以影响小胶质细胞炎症反应，相反，促炎环境也可能调节自噬水平，如脂多糖诱导的小胶质细胞炎症模型中，自噬相关蛋白LC3和p62表达增加[29]。

2.4 自噬在星形胶质细胞中的作用

星形胶质细胞通常被认为是“管家细胞”，可以促进神经元的健康生存,该作用包括通过控制离子成分及摄取神经递质等监测和维持细胞外区域的稳定，响应神经元活动，调节血流和循环，维持血脑屏障和维持突触功能等[37]。脊髓损伤后原始星形胶质细胞依次表现出不同的表型，先是反应性星形胶质细胞，再是形成疤痕的星形胶质细胞。GFAP是仅在星形胶质细胞中表达的中间丝，星形胶质细胞受刺激后其表达水平会大大增加[38]。关于星形胶质细胞自噬的机制或功能知之甚少。自噬激动剂雷帕霉素可抑制星形胶质细胞增殖并减少病变部位表达GFAP的细胞数量，但自噬抑制剂3-MA降低星形胶质细胞数量[39]。最近的研究表明脊髓继发性损伤中反应性星形胶质细胞死亡是通过坏死性病变，而不是通过自噬发生[40]。但是，有必要做进一步研究来确定自噬如何影响中枢神经系统损伤后星形胶质细胞的存活和功能，以了解继发性脊髓损伤机制并改善功能恢复。

3 小结和展望

脊髓损伤是难治性疾病，自噬参与调节多种疾病、细胞功能和中枢神经系统创伤,可能是未来治疗脊髓损伤的突破口。我们需要更深入地了解继发性脊髓损伤引起的自噬反应，自噬可通过降解受损细胞器和多余蛋白质维持细胞稳态，但过度自噬引起过度的自我消化和基本细胞成分降解可导致细胞死亡。自噬增强药物能显著影响多种细胞类型，促进神经元和少突胶质细胞存活，促进少突胶质细胞分化，减轻神经炎症。然而，关于脊髓损伤不同阶段的自噬作用和具体分子机制还有待进一步研究。