中国汉族结直肠癌患者UGT1A1*28基因多态性分析

滕祥云，王新梦，刘 维，樊 慧，李 琦

(长沙三济生物科技有限公司,长沙 410205)

结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，在我国结直肠癌的死亡率位于全部恶性肿瘤死亡率的前6位，对人类健康产生严重影响[1]。伊立替康是一种治疗转移性结直肠癌的特效药，与氟尿嘧啶联合使用，可以延长结直肠癌患者的生存期[2]。但是，伊立替康因其毒副作用的影响(尤其是严重的延迟性腹泻以及骨髓抑制)，使用受到一定的限制。而引起伊立替康产生毒副作用发生的机制可能与遗传基因多态性有关。

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(uridine diphosphate glucuronosyltransferase，UGT)是 体 内重要第II相生物转化代谢酶，分为UGT1和UGT2两个家族。UGT1A1启动子区存在大量的TA碱基重复序列(TA6或TA7)，随着TA重复序列数目的增加，UGT1A1表达下降，将导致伊立替康代谢产物SN-38在体内过度蓄积，从而引发严重的毒副反应[3]。美国食品药品监督管理局(FDA)在伊立替康和UGT1A1的标签中表明，UGT1A1*28纯合基因型(TA7/ TA7)使用伊立替康进行治疗时，中性粒细胞减少增加。

有研究发现，UGT1A1 基因多态性的分布在不同种族间存在明显差异[4]，为进一步明确中国汉族结直肠癌人群UGT1A1*28位点基因多态性的分布特点及差异，本研究采用焦磷酸测序技术对505例汉族结直肠癌患者UGT1A1*28的基因多态性进行检测，比较不同性别、年龄段及地区汉族结直肠癌患者中UGT1A1*28基因型分布特点，为结直肠癌人群的UGT1A1*28基因筛查及个体化用药提供理论依据，有效减少临床延迟性腹泻以及骨髓抑制等不良事件的发生。

1 材料与方法

1.1 研究对象 505例结直肠癌患者的临床样本来自全国49家医疗机构于2016～2017年送检的血液标本，每份样本均通过病理检查确诊。其中，男性311例，平均年龄58.10±11.19岁；女性194例，平均年龄56.19±11.73岁。

1.2 试剂与仪器 DNA提取试剂盒、测序反应通用试剂盒(长沙三济生物科技有限公司)；焦磷酸测序试剂、 Qiagen PyroMark Q24 焦磷酸测序仪(德国凯杰公司)；PCR扩增引物和焦磷酸测序引物(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA的提取：按照DNA提取试剂盒说明书进行。

1.3.2 引物设计：见表1。采用PyroMark Assay Design Software2.0(德国凯杰公司)软件设计PCR引物和焦磷酸测序引物。

表1 UGT1A1*28 位点的引物序列

1.3.3 焦磷酸测序法检测UGT1A1*28的基因多态性 ：按照仪器和试剂盒说明书进行PCR扩增、焦磷酸测序，并通过Qiagen PyroMark Q24(德国凯杰公司)软件对测序结果进行分析，根据出峰的碱基和峰高判断UGT1A1*28的基因型。

1.4 统计学分析 应用SPSS18.0统计软件处理数据，计量资料采用均数±标准差(±s)表示，计数资料以频数表述，组间比较采用 χ2检验或Fisher精确检验，Hardy-Weinberg 遗传平衡检验采用Person χ2检验。

2 结果

2.1 PCR产物测序结果 采用焦磷酸测序技术，检测UGT1A1*28基因多态性，其代表性结果见图1。

图1 UGT1A1*28焦磷酸测序结果

2.2 UGT1A1*28基因型分布情况 UGT1A1*28的3种基因型分布频率为TA6/TA6：74.26%，TA6/TA7：22.97%，TA7/TA7：2.77%，等位基因的分布频率为TA6：85.74%，TA7：14.26%，检测结果符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.84，P ＞ 0.05)。

2.3 中国汉族结直肠癌患者UGT1A1*28基因型和等位基因分布 505例结直肠癌患者中，UGT1A1*28野生型(TA6/TA6)、杂合型(TA6/TA7)、突变纯合型(TA7/TA7)频率分别为74.26%，22.97%和2.77%。通过对不同性别、年龄段以及地区UGT1A1*28基因型和等位基因数据进行分析发现，基因型分布和等位基因分布与患者性别、年龄以及地区之间差异无统计学意义(P ＞ 0.05)，见表2。

3 讨论

UGT1A1基因位于染色体2q37，是尿苷酸二磷酸葡萄醛酸转移酶中的一员，其基因产物的主要作用是醛酸化各种外源性药物以及内生底物葡萄糖，使其更好地被清除，包括伊立替康、胆红素等。伊立替康(Irinotecan, CPT-11)，是一种DNA拓扑异构酶I抑制剂，是目前治疗转移性结直肠癌最有效的化疗药物之一[5]，主要在肝脏内进行代谢，形成活性代谢产物7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)，SN-38的细胞毒性大大增强，从而导致毒副作用的发生。UGT1A1是伊立替康的重要代谢酶，该基因位点存在50多种基因多态性，其中以UGT1A1*6和UGT1A1*28与伊立替康疗效和安全性研究为主[6-7]，UGT1A1*28启动子区存在大量的TA碱基重复序列，随着TA重复序列数目的增加，UGT1A1酶活性下降，使得SN-38在体内蓄积，从而引发严重的毒副反应[3]。2005年FDA批准UGT1A1*28用于预测伊立替康的不良反应。

结直肠癌是一种世界范围的消化道常见恶性肿瘤，发病率位于第三位[8]。在我国，结直肠癌的发病率约为37.6/10万，死亡率约为19.1/10万[9]，并且呈现上升趋势，成为中国社会重要的健康负担，尤其是在较为发达的省份[10]。以往研究表明UGT1A1*28基因多态性与伊立替康疗效及不良反应密切相关，并且UGT1A1*28基因多态性有地域和种族差异。本次研究中中国汉族结直肠癌患者中UGT1A1*28 的3种基因型发生率与国内汉族人群相关报道结果一致[11-12]。UGT1A1*28的基因型分布频率为TA6/TA6：74.26%，TA6/TA7：22.97%，TA7/TA7：2.77%，等位基因的分布频率为TA6：85.74%，TA7：14.26%。UGT1A1*28的3种基因型及两种等位基因分布与中国汉族结直肠癌患者的性别、年龄、地区差异无关。但在新疆维吾尔族人群[13]中， TA6与TA7两种等位基因的频率分别为30.93%和69.07%，两者之间存在差异性。与国外研究相比，泰国[14]UGT1A1*28基因频率分布与我国相似，沙特阿拉伯[15]、秘鲁和墨西哥[16]TA7等位基因频率高于我国。由此可知，UGT1A1*28基因频率存在种族差异性，相比于白种人，TA7等位基因在中国人群中的频率较低。

综上所述，UGT1A1是伊立替康重要的代谢酶，UGT1A1*28基因多态性可以预测伊立替康不良反应，但是UGT1A1*28在白种人群中突变率较高，而在中国人群中突变率较低，在对中国人使用伊立替康治疗时，是否需要检测UGT1A1*28多态性，尚无一致的定论。本次研究还存在很多局限性，本次研究结果还需要更广泛的地区，更大的样本量进一步验证。