CaBP4基因突变与儿童癫痫的相关性研究

张玲如，周美宁，肖 珊（.陕西省友谊医院神经内科，西安 70068；

2.西安高新医院神经内科，西安 710075）

癫痫属于一种次常见的小儿神经系统疾病，其发病原因主要受多种因素影响，易引发脑功能障碍综合征[1]。有研究指出[2]，癫痫病理基础主要是脑细胞群放电异常，与脑能量代谢异常紧密相关。临床癫痫诊断主要依靠CT和MRI等技术诊断显示癫痫患儿发病时脑电生理、结构均发生改变，但不能有效反映脑细胞代谢和功能变化[3]。遗传学和生物学研究指出[4]，神经元细胞核中编码离子通道基因突变会影响膜通道蛋白发生改变，从而导致通道性质以及结构发生改变，这一变化与癫痫发病有关。基因异常会影响离子通道作用，有研究指出[5]，编码神经元离子通道基因突变与癫痫综合征有关。基因异常会促进兴奋性神经因子释放，增加离子通道功能，减轻神经递质作用，进而引发癫痫。钙连接蛋 白4（Ca2+-bingding protein 4，CaBP4）是一种类似于钙调节蛋白的神经元钙连接蛋白，主要作用和钙调节蛋白相似，对电门控钙离子通道、瞬间受体电位蛋白通道等起到调节作用，同时对神经元和其他可兴奋性细胞钙信号电位有增加效果[6-7]。临床数据显示[8]，CaBP4基因突变与2B型先天性静止性夜盲症具有相关性。KHAN 等[9]研究发现，CaBP4蛋白属于钙连接蛋白家族中的一员，主要存在于视感受器突触末端中，受Cav1.4通道的影响，CaBP4基因突变会导致先天性静止性夜盲症发生，CaBP4蛋白表达水平降低是先天性静止性夜盲症发病的重要原因。本文旨在研究CaBP4基因突变与小儿癫痫临床特点的相关性，为小儿癫痫的临床诊断和治疗提高数据支持。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本文选取2016年3月～2018年3月在我院就诊的额叶癫痫儿童60例，男性35例，女性25例，年龄1～12岁，平均年龄6.3±2.1岁。根据发作类型分为简单部分性发作21例，强直-阵挛发作15例，复杂部分性发作17例，肌阵挛发作4例，强直性发作3例；根据发作程度分为轻度25例，中度14例，重度21例。患儿癫痫2个月发作1次为轻度癫痫，1个月发作＜4次为中度癫痫，1个月内发作＞4次，并且为持续状态为重度癫痫。

纳入标准：所有患儿均经过脑电图、MRI等检查确诊为癫痫；所有患儿均符合2001年国际抗癫痫联盟以及中国癫痫的诊断标准[10]；发病前智力运动发育正常患儿。

排除标准：血细胞检测以及尿代谢异常患儿；进行抗癫痫药物治疗患儿；发病前智力运动发育异常患儿；并发颅内感染、先天性脑发育畸形、遗传代谢疾病患儿。本文研究患儿家属均知情，签署知情通知书，经过我院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 DNA提取试剂盒（北京天漠科技开发有限公司），限制性内切酶（TaKaRa公司），PCR扩增试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司），电泳试剂盒（赫澎生物上海科技有限公司）；电泳缓冲液（上海哈灵生物科技有限公司），紫外线凝胶成像分析系统（南京世研仪器设备有限公司）等。

1.3 研究方法

1.3.1 临床相关资料统计：由专门医护人员统计癫痫患儿的性别、首发病年龄、月发作频率、发作程度（轻度、中度、重度）、发作类型（简单部分性发作、复杂部分性发作、强直-阵挛发作、肌阵挛发作、强直性发作）等临床特征。

1.3.2 CaBP4基因突变分布：按照DNA提取试剂盒提取患者外周血DNA，置于-20℃环境中保存备用。按PCR扩增试剂盒配置反应体系15μl，后利用扩增仪进行DNA扩增， PCR反应条件：94℃环境预处理5min，94℃变性处理30s，60℃退火30s，72℃延伸处理30s，72℃终末延伸5min，总计循环30次。酶切：酶切酶为FastDigest Csp6I，试剂添加为Csp6I 0.8μl，缓冲液1.6μl，加入13.6μl三蒸水，将16μl混合液混入8μl DNA产物中，37℃水浴5min后80℃水浴灭活10min。依据琼脂糖凝胶电泳试剂盒进行电泳处理及测序：使用2g/dl琼脂糖凝胶电泳，电压150V，时间45min，后利用紫外线凝胶成像分析系统进行基因分型。

1.4 统计学分析 采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析处理。计数资料采用n（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料采用均值±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验； CaBP4基因突变与癫痫患儿临床特征的相关性分析采用多因素Logistic回归分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CaBP4基因突变率分布情况 60例癫痫患儿中，CaBP4基因p.G155D突变阳性患者33例，突变率为55.0%；CaBP4基因未突变患儿27例，未突变率为45.0%。

2.2 CaBP4基因突变与小儿癫痫临床资料的关系 60例癫痫患儿中，CaBP4基因p.G155D突变患儿男性20例（60.6%），女性13例（39.4%），首发病年龄3.2±0.8岁；CaBP4基因未突变患儿男性15例（55.6%），女性12例（44.4%），首发病年龄6.3±1.6岁。两组间比较CaBP4基因突变与小儿癫痫性别差异无统计学意义（χ2=0.156，P=0.693）；与小儿癫痫首发病年龄有关，CaBP4基因p.G155D突变患儿首发病年龄低于CaBP4基因未突变患儿，差异有统计学意义（t=9.752，P＜0.000）。

2.3 CaBP4基因突变与小儿癫痫月发作频率和发作程度的关系 60例癫痫患儿中，CaBP4基因p.G155D突变患儿月发作频率4.5±1.0次，发作程度：轻度9例（27.3%）、中度8例（24.2%）、重度16例（48.5%）；CaBP4基因未突变患儿月发作频率2.1±0.5次，发作程度：轻度16例（59.3%）、中度6例（22.2%）、重度5例（18.5%）。两组间比较CaBP4基因突变与小儿癫痫月发作频率和发作程度均有关， CaBP4基因p.G155D突变患儿月发作频率高于CaBP4基因未突变患儿，差异有统计学意义（t=11.352，P＜0.000）；CaBP4基因p.G155D突变患儿重度发作率高于CaBP4基因未突变患儿，差异有统计学意义（χ2=7.482，P=0.024）。

2.4 CaBP4基因突变与小儿癫痫发作类型的关系 见表1。对比发现，CaBP4基因p.G155D突变患儿其简单部分性发作率、复杂部分性发作率、强直-阵挛发作率高于CaBP4基因未突变患儿，肌阵挛发作率、强直性发作率低于CaBP4基因未突变患儿，组间比较差异均具有统计学意义（χ2=9.962，P=0.041）。

表1 CaBP4基因突变对癫痫患儿发作类型的影响[n（%）]

2.5 CaBP4基因突变与癫痫患儿临床特征的多因素回归分析 见表2。分析发现，CaBP4基因突变与癫痫患儿的首发病年龄、月发作频率、发作程度及发作类型有关，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）；而与癫痫患儿性别无关（P＞0.05）。

表2 CaBP4基因突变与癫痫患儿临床特征的多因素回归分析

3 讨论

癫痫属于神经系统常见疾病，其发病具有遗传性。额叶癫痫是一种特发性癫痫，在儿童期、青少年早期易发病，其主要发作起源是额叶的丛集性发作，其发作与睡眠有关。研究指出患儿在睡眠期2期时常为癫痫发作，主要表现为过度运动发作[11]。通过临床神经系统诊断，患者智力表现正常，有较少的患者出现精神轻度损伤[12]。研究指出，基因异常会影响机体神经系统发育，调控神经元分化、发育，而基因突变会导致神经元产生异常的神经元网络，从而导致癫痫发作[8，13]。CaBP4基因位于染色体11q13.2，全长为828bp，包括6个外显子编码区，编码产物由275个氨基酸的CaBP4组成[14]。CaBP4蛋白参与视感受器突触的发育和生长，在神经元的L型钙通道以及神经递质的释放起到促进作用[12，15]。

本研究结果显示，60例额叶癫痫患儿中，CaBP4基因p.G155D突变阳性患者为33例，其突变率为55.0%。说明额叶癫痫中p.G155D突变型是CaBP4基因突变的主要型。LITTINK 等[16]研究指出，CaBP4基因突变主要与2B型先天性静止性夜盲症有关。而本研究探究发现CaBP4基因突变与小儿癫痫性别无关，说明癫痫患儿的年龄与CaBP4基因p.G155D突变无关。小儿癫痫首发病年龄低于CaBP4基因未突变患儿，说明CaBP4基因p.G155D突变与患儿的首发年龄有关。李丹等[17]在研究中指出，SCNIA基因突变与Dravet综合征患儿发病年龄有关，SCN1A基因突变阳性患儿发病年龄较早。本文研究也证实，额叶癫痫患儿发病与CaBP4基因p.G155D突变阳性有关。曾琦等[18]在研究中指出，SCN2A基因突变主要在新生儿期或婴儿早期起病，说明SCN2A基因突变与首发病年龄有关。

本研究中，CaBP4基因p.G155D突变患儿月发作频率高于CaBP4基因未突变患儿，重度发作CaBP4基因p.G155D突变患儿高于CaBP4基因未突变重度患儿，说明CaBP4基因突变与小儿癫痫月发作频率和发作程度有关。同时研究结果显示，CaBP4基因p.G155D突变患儿其简单部分性发作率、复杂部分性发作率及强直-阵挛发作率显著高于CaBP4基因未突变患儿，说明CaBP4基因突变与小儿癫痫发作类型有关。赵滢等[19]研究显示，在ARX基因突变患儿中，主要是早发性癫痫脑病患儿，主要发作类型为部分性发作及痉挛发作，并且患儿的智力运动发育显著落后，甚至严重倒退。本文通过对癫痫患儿首发病年龄、月发作频率、发作程度、发作类型进行研究，结果显示，CaBP4基因p.G155D突变主要与额叶癫痫患儿的首发病年龄、月发作频率、发作程度、发作类型有关，其中首发病年龄早、月发作频率高、发作程度重、简单部分性发作、复杂部分性发作、强直-阵挛发作的癫痫患儿CaBP4基因p.G155D突变率较高。

综上所述，CaBP4基因p.G155D突变，癫痫患儿首发病年龄越早、月发作频率越高、发作程度越严重，癫痫发作类型不同，CaBP4基因p.G155D突变率存在差异。为小儿癫痫的临床诊断和治疗提供数据支持。