空肠弯曲菌TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR快速检测

高正琴（中国食品药品检定研究院，北京 100050）

空肠弯曲菌（Campylobabter jejuni）是一种微需氧、革兰阴性螺旋形细菌，可寄生于胃肠道黏膜组织，是全世界细菌性食源性肠炎最常见的病因[1-4]。空肠弯曲菌与不同的胃肠道疾病有关，包括肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）、炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）、巴雷特食管和结肠直肠癌。感染后可引起菌血症、反应性关节炎、肺部感染、脑脓肿、脑膜炎，以及极少数受感染个体中被称为格林-巴利综合征（guillain-barre syndrome，GBS）和米勒-费希尔综合征（miller fisher syndrome，MFS）的自身免疫性疾病。免疫缺陷者和免疫功能低下患者空肠弯曲菌感染的发生率较高，且表现为较严重的腹泻和机体持续性疾病。该菌在组织中的存在与黏膜相关淋巴 组 织 瘤（mucosa associated lymmphoid tissue type，MALT）有关[5-10]。因此，在该菌感染早期就能够快速准确诊断病因，对疾病暴发流行的防控有着重要意义。尽管细菌学方法可检出该菌，得出确定性诊断结论，然而其所需微需氧条件苛刻，分离鉴定耗时费力，无法满足快检要求。免疫荧光、酶联免疫吸附试验等血清学方法可用于临床样本批量检测，但因该菌与其他细菌抗原存在交叉反应限制了此类方法使用。近年来，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）、核酸杂交、生物芯片、基因测序等基因诊断技术在感染性疾病诊断中发挥着越来越重要的作用。因此，本研究建立了一种快速简便、灵敏特异检测空肠弯曲菌的TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR方法，联合细菌培养和基因克隆测序鉴定技术，成功应用于临床标本中空肠弯曲菌定量检测，为疾病感染早期诊疗提供病原学依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象 1例临床空肠弯曲菌感染腹泻病人粪便由北京某医院提供。25例小型猪肠内容物、10例猴和10例犬粪便由北京某单位提供，32例地鼠肠内容物由四川某单位提供。

1.2 标准菌株 空肠弯曲菌ATCC 700819（NCTC 11168）购自美国标准菌种收藏所。肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）CMCC 50041小肠结肠炎耶尔氏菌（Yersinia enterocolitica）CMCC 52302，福氏志贺菌（Shigella flexneri ）CMCC 51573、大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC 44711购自中国医学细菌保藏管理中心。含有空肠弯曲菌鞭毛蛋白A（flagellin A，flaA）基因和马尿酸酶（hippuricase，hipO）基因的质粒由本实验室构建保存，质粒标准品DNA定量为4.0×1010拷贝/μl。

1.3 试剂和仪器 DNA小量提取试剂盒为德国Qiagen公司产品。TaqMan通用PCR 预混液为美国Life Technologies公司产品。无菌无核酶水为美国Progema公司产品。dNTP Mixture，EX Taq聚合酶、琼脂糖、DNA Marker购自日本TaKaRa公司。Camp-BAP，Skirrow-BAP，mCCDA，Nutrient Broth No.2购自英国Oxoid公司。微厌氧培养系统购自日本三菱瓦斯化学株式会社。7500 Fast全自动荧光定量PCR仪、Verity 96 Thermal Cycler基因扩增仪购自美国Life Technologies公司。Gel Logic凝胶成像分析系统购自东乐自然基因生命科学公司。生物安全柜购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 方法

1.4.1 空肠弯曲菌分离和DNA提取：在生物安全柜内，对临床标本作特定处理并经微孔滤膜过滤去除大的杂菌和相关残渣再接种Camp-BAP，mCCDA，Skirrow-BAP，于42℃微厌氧培养系统培养48 h。挑取疑似菌落涂片镜检，实时动态显微视频摄录菌体呈弧形作螺旋状运动，将初步分离获得的存活菌株纯化后，转种Nutrient Broth No.2于42℃微厌氧培养48 h，接种1.0%甘氨酸、3.5%氯化钠肉汤、1%（w/v）马尿酸钠培养基和茚三酮溶液进一步鉴定。用DNA小量提取试剂盒提取临床标本和标准菌株DNA。

1.4.2 空肠弯曲菌TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR引物探针设计和反应体系的确立：根据GenBank中公布的空肠弯曲菌ATCC 700819（登录号：NC_002163）fl aA基因和hipO基因序列设计实时荧光定量PCR引物和TaqMan-MGB探针，序列见表1。引物探针由美国Life technologies公司合成。

表1 空肠弯曲菌TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR引物序列

在前期大量TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR研究工作的基础上，优化反应条件和反应体系，实现最佳扩增效率，选用的20 μl总反应体积包括：TaqMan通用PCR预混液10 μl，探针引物1 μl，模板DNA 1μl，无菌无核酶水8 μl。反应参数：50℃ 2 min，1个循环；95℃ 10 min，1个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40个循环。每次试验均用无菌无核酶水作为阴性模板对照（negative template controls，NTC），空肠弯曲菌ATCC 700819 DNA作为阳性对照。用7500 Fast全自动荧光定量PCR仪检测。实时观察荧光信号采集试验数据。使用仪器自带软件进行数据分析。阈值设定原则：阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数即为Ct值。

1.4.3 标准曲线制备、特异度和灵敏度检验：取空肠弯曲菌质粒标准品DNA（4×1010拷贝/μl）进行10倍倍比稀释，使之成为4×109拷贝/μl～4×100拷贝/μl，每个稀释度取1 μl作为模板，各浓度梯度分别设3个平行重复孔，同上条件进行试验，获得系列标准模板的Ct值，制备标准曲线，用以确定待测样本中DNA含量[11]。

分别取1 μl空肠弯曲菌ATCC 700819、肠炎沙门氏菌CMCC 50041、小肠结肠炎耶尔氏菌CMCC 52302、福氏志贺菌CMCC 51573、大肠埃希菌CMCC 44711 DNA作为模板同上条件进行试验，验证该方法的特异度。

用比浊法和平板计数法对空肠弯曲菌ATCC 700819进行计数，取4×109CFU/ml菌悬液进行10倍倍比稀释，使之成为4×108CFU/ml～4×100CFU/ml，分别提取DNA作为TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR模板进行试验，验证该方法的敏感度。

1.4.4 重复性和稳定性检验：分别取1 μl质粒标准品DNA（4×106拷贝/μl～4×102拷贝/μl）为模板DNA，各浓度梯度分别设3个平行重复孔，同上条件进行试验，统计分析组内相对标准偏差，然后取相同浓度质粒DNA为模板，同上条件连续3天进行3次独立的重复试验，统计分析组间相对标准偏差，验证该方法的重复性。

取本研究用探针引物、质粒DNA及配套试剂，置于不同温度（-70℃，-20℃，4℃），经不同时间（90，180，360天），再同上条件进行试验，用以考察该方法的稳定性。

1.4.5 临床标本检测 以临床标本和空肠弯曲菌分离株DNA为TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR模板同上条件进行试验，同时进行普通PCR检测、基因克隆和测序鉴定。

空肠弯曲菌普通PCR引物见表2。50 μl PCR反应体系如下：10×Buffer （Mg2+Plus） 5.0 μl，dNTP Mixture 4.0 μl，正、反向引物各0.5 μl， EX Taq聚合酶0.25 μl，模板DNA 3.0 μl，无菌无核酶水37.25 μl。PCR反应循环参数：95℃ 1 min，1个循环；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min，1个循环。每次试验均用无菌无核酶水作为阴性模板对照，空肠弯曲菌ATCC 700819 DNA作为阳性对照。用Verity 96 Thermal Cycler基因扩增仪检测。1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。Gel Logic凝胶成像分析系统记录结果。阳性样本进一步测序鉴定。

表2 空肠弯曲菌普通PCR引物序列

1.5 统计学分析 线性拟合采用Excel软件进行，相关及回归分析采用SPSS22.0统计软件进行分析。

2 结果

2.1 方法特异度和敏感度评价结果 空肠弯曲菌flaA基因和hipO基因模板DNA浓度在4×109拷贝/μl～4×100拷贝/μl范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.999,扩增效率为101%。回归方程：Y=-3.289X+39.667。

TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR检测空肠弯曲菌ATCC 700819时出现特异性扩增曲线，Ct=25.96；肠炎沙门氏菌CMCC 50041、小肠结肠炎耶尔氏菌CMCC 52302、福氏志贺菌CMCC 51573、大肠埃希菌CMCC 44711均未出现特异性扩增曲线，Ct=Undet.。结果显示，该方法专属性强，能准确检出空肠弯曲菌，而与其他细菌无交叉反应，特异度为100%。

用该方法检测空肠弯曲菌ATCC 700819的DNA标准对照，定量线性范围为4×108CFU/ml～4×100CFU/ml，均出现特异性扩增曲线，Ct值均小于35。结果表明，该方法检测空肠弯曲菌最低检测限可达4 CFU/ml，灵敏度高。标准曲线、特异性、敏感性结果见图1。

2.2 方法重复性和稳定性评价结果 如表3。该检测方法相对组内标准偏差在0.16%～0.77%之间，组间相对标准偏差在0.2%～0.64%之间，组内和组间标准偏差均小于1%。将TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR配套试剂置于不同温度近1年未影响其使用性状，试验用酶、质粒标准品未发生降解，探针引物未出现荧光衰减现象，选取不同时间段测试相关系数和扩增效率未发生显著变化。结果表明，该方法重复性好、稳定性佳。

图1 空肠弯曲菌TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR标准曲线、特异度、敏感度试验结果

表3 空肠弯曲菌TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR重复性试验结果

2.3 临床标本检测结果 用本研究建立的TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR对临床标本进行空肠弯曲菌检测，用阴性对照、阳性对照和灵敏度质控标准品进行有效性验证。质量控制原则：阴性对照：未出现特异性扩增曲线或Ct=Undet；阳性对照：出现特异性扩增曲线或Ct≤30.0；灵敏度质控标准品出现特异性扩增曲线且Ct值在15.0～30.0之间，以上要求必须在同一实验中同时满足，否则本次实验无效。检验结果的判定：当待测样本出现特异性扩增曲线且Ct≤35.0时为空肠弯曲菌核酸阳性；当待测样本未出现特异性扩增曲线或Ct=Undet时为空肠弯曲菌核酸阴性；对于Ct＞35.0的样本，应重新检测，Ct值仍＞35.0的样本判为阴性，Ct≤35.0的样本判为阳性。78份临床标本经检测：28份标本出现特异性扩增曲线且Ct＜30.0，判为空肠弯曲菌核酸阳性（图2）。阳性标本中空肠弯曲菌核酸载量在4×106拷贝/μl～4×102拷贝/μl之间。由图可知，临床病人标本、猴、犬标本中空肠弯曲菌核酸载量较高，小型猪、地鼠标本中该菌核酸载量较低。临床病人1例空肠弯曲菌阳性Ct值为15.71，猴4例Ct值分别为15.72，11.7，29.75和28.28。犬5例Ct值分别为13.59，12.73，12.97，29.28和21.74。小型猪12例Ct值分别为：27.54，26.84，27.1，26.79，28.19，28.02，28.51，27.21，26.95，28.19，26.03和27.41。地 鼠6例Ct值分 别 为：26.55，25.72，29.77，29.67，29.25和26.31。同时用普通PCR对这28例空肠弯曲菌核酸阳性标本进行fl aA基因扩增，均出现1 719 bp特异性目的基因片段（图3），分子量标准为100 bp DNA Ladder Marker。结果表明：普通PCR检测结果与TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR检测结果相一致。用细菌学检查方法仅从临床病人、猴、犬、小型猪阳性标本中分离获得6株存活的空肠弯曲菌。用普通PCR均可扩增出这6株空肠弯曲菌fl aA基因特异性片段，目的片段经胶回收、连接、转化、克隆鉴定，阳性菌液测序，序列分析比对结果显示与GenBank中已公布的空肠弯曲菌fl aA基因序列同源性达100%，确证为空肠弯曲菌。

图2 TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR检测临床样本中空肠弯曲菌结果

图3 普通PCR检测临床样本中空肠弯曲菌结果

3 讨论

空肠弯曲菌菌株NCTC 11168于1977年保存在国家菌种保藏中心（national collection of type cultures，NCTC），是第一个完整发表基因组的弯曲杆菌[12-13]。目前尚未见国内外有用TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR特异性检测空肠弯曲菌的报道。本研究针对空肠弯曲菌fl aA和hipO基因分别设计两套引物探针，应用TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR检测空肠弯曲菌标准菌株和临床标本，有效克服了单基因覆盖面不全的问题，同时用普通PCR、基因克隆测序验证，细菌分离培养确证，避免产生假阳性和假阴性结果，有效保障了临床标本检测的可靠稳定性。在本研究抗干扰检测中，用肠炎沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、福氏志贺菌、大肠埃希菌等相关感染性腹泻肠道致病菌进行TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR检测，均未出现特异性扩增曲线，显示该方法检测空肠弯曲菌特异性较强。空肠弯曲菌的感染致病剂量约为102CFU/ml，而分离培养检出限约为104CFU/ml，在本研究中空肠弯曲菌最低检测限可达4 CFU/ml，灵敏度高，完全符合临床复合标本特定检验要求。本方法能在得到样本后2 h得出检测结果，大大缩短了检测所需时间，真正实现了快速诊断。应用本研究建立的TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR方法从78例临床标本中检出28例阳性标本，而分离培养只是获得6株存活的空肠弯曲菌，原因是多方面的。将空肠弯曲菌与其他弯曲菌的种区别开来的主要试验是马尿酸钠水解试验。在42℃下，用选择性培养基分离培养到的菌株，氧化酶阳性，具有显微镜下的形态学特征，并且马尿酸钠水解试验阳性，即可确定为空肠弯曲菌。在特定的时空下，空肠弯曲菌某些菌株马尿酸酶基因处于不分泌或表达下调状态，生化鉴定时马尿酸钠水解试验可能呈现阴性或弱阳性，这样势必会造成这些菌株的漏检[14-15]。空肠弯曲菌分离培养所需微厌氧条件比较特殊，暴露于有机酸低温氧化等多种胁迫条件下，该菌则易变为球形或活的非可培养状态（viable but non-culturable state，VBNC），加之临床抗生素治疗也会抑制该菌生长，使其分离培养率低[16-17]。BEROAL等[18]最近报道住院腹泻患者粪便弯曲杆菌PCR检测呈阳性而培养结果呈阴性，指出PCR阳性结果应在评估非感染性腹泻相关条件后在临床环境中解释但不能作为单独的诊断工具。

综上所述，本研究建立的空肠弯曲菌TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR检测方法，具有快速简便、特异度强、灵敏度高、重复性好、稳定性佳的特性，该方法的建立对食品药品生物制品中空肠弯曲菌的安全性检验具有重要价值，同时也为疾病感染早期快速诊断、满足快速应急检验需要、开展分子流行病学调查提供了新的技术手段，值得推广使用。