基于LAMP技术针对溶藻弧菌gyrB基因快速检测方法的建立

陈昌国，陈秋圆，侯兵兵，刘新萍,董优优

（解放军总医院第六医学中心检验科，北京 100048）

溶藻弧菌是一种常见的嗜盐性革兰氏阴性弧菌，有较强的适应性和抗逆性，广泛分布于海水及河口入海处，其数量在海洋各类弧菌中居于首位[1-3]。溶藻弧菌由Miyamoto在1961年命名，其生物学特性与副溶血弧菌有较多相似之处，是水生动物弧菌病的主要病原菌之一[1,4-5]。此外，溶藻弧菌不但会引起多种人类感染性疾病，如伤口感染、食物中毒及中耳炎等，严重时可引起败血症危及生命[6-9]；而且，该菌是沿海地区感染性腹泻和食物中毒的主要病原菌之一，其作为致病菌的相关研究日益受到重视[10-11]。

目前，分子生物学检测溶藻弧菌的靶点有16s rRNA 基因、colH基因、dnaJ40基因以及hsp60基因等[10]。虽然16s rRNA 基因是细菌分子系统鉴定的“金标准”，但其进化上的过度保守不利于区分相似种，而更适用于种以上水平的鉴定[12-13]。gyrB即促旋酶（gyrase）B亚基，其在细菌中广泛存在，与16sRNA相比，gyrB基因进化速度更快且在近乎全部细菌中呈单拷贝形式，更适用于细菌种的鉴定。在弧菌中gyrB基因具有较高同源性，不同弧菌之间具有明显遗传距离，其稳定准确区分不同弧菌的特点使得它可以作为检测的靶点[14]。本实验以溶藻弧菌gyrB基因为研究对象，基于LAMP技术建立一种溶藻弧菌的快速检测方法，实验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 实验使用的菌株包括：溶藻弧菌ATCC-17749（由李艳君博士提供）、溶藻弧菌野生株-WT (由本科室分离并保存)、粪肠球菌ATCC-29212、金黄色葡萄球菌ATCC-25293、腐生葡萄球菌ATCC-BAA750、霍氏肠杆菌ATCC-700323、铜绿假单胞菌ATCC-27853、大肠埃希氏菌ATCC-25922菌株均为本科室保存。

1.2 试剂和仪器 普通恒温水浴，凝胶电泳仪均是本科室常用设备。0.1mmol/L MgSO4溶液，10×Reaction Buffer,Solution Mix, Bst DNA聚合酶均购自New England Biolabs公司，特异性引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，后期处理按照引物合成单说明进行操作,引物序列见表1。

表1 gyrB基因LAMP引物序列

1.3 方法

1.3.1 细菌核酸粗提物制备：将菌种从-80℃冰箱取出后快速复温并接种在TCBS、哥伦比亚血平板上，将平板置孵箱中37℃培养12h，取适量细菌至含有100μl核酸裂解液的EP管中，室温裂解15min,中间涡旋振荡3次，100℃恒温金属浴加热10min， 1 3000r/min室温离心5min,取上清作为模板。

1.3.2 LAMP反 应 体 系：10×Bst r/min buffer 2.5 μl,MgSO4(25mmol/L) 1.2μl，dNTP (10mmol/L) 1.6 μl，内引物各0.8μmol，外引物各0.2μmol，Bst DNA聚合酶 (8 U/μl) 1μl，DNA模板2 μl，ddH2O 15.7 μl。

1.3.3 反应温度的优化：将相同反应混合液在不同的温度下(60，61，62和63℃）反应60min，80℃灭活5min，取5μl反应产物在2g/dl凝胶中进行电泳，以出现清晰明显条带的反应温度为优，确定最佳反应温度。

1.3.4 反应时间的优化：将相同反应混合液在61℃分别反应60 min和90 min，然后80℃灭活5 min，将反应产物在2g/dl凝胶中进行电泳，以出现条带的清晰程度判断反应时间对扩增效果的影响。

2 结果

2.1 不同温度下扩增效果的比较 凝胶电泳结果见图1。不同反应温度获得的扩增效果不一，61℃条件下得到的gyrB扩增产物电泳条带最清晰明显，提示61℃为适宜反应温度。

图1 不同温度gyrB基因LAMP扩增产物凝胶电泳结果

2.2 不同反应时间扩增效果的比较 见图2。在61℃反应60 min和90 min扩增效果相差不大，反应条件使用60min反应时间即可满足实验要求。

图2 不同反应时间gyrB基因LAMP扩增效果

2.3 特异性评价 使用优化后的LAMP反应体系对溶藻弧菌野生株、溶藻弧菌标准菌株及其它6种常见致病细菌的标准株进行扩增，电泳结果显示仅溶藻弧菌标准菌株和溶藻弧菌野生株有gyrB基因阳性扩增条带，其它6种常见致病细菌标准株均无扩增条带，见图3。提示该反应体系的特异度较好。

图 3 溶藻弧菌标准菌株、溶藻弧菌野生株及其它种细菌gyrB基因扩增条带

2.4 灵敏度评价 将溶藻弧菌标准株提取的核酸母液进行系列稀释作为扩增反应模板，当浓度为102mg/L～10-4mg/L时，每个浓度均有gyrB阳性扩增条带，当浓度为10-5mg/L时未出现gyrB扩增条带。所以，该反应体系的检测灵敏度为10-4mg/L，与我们前期Taqman荧光定量PCR结果相比[20]具有较好的灵敏度，见图 4。

图4 不同浓度核酸gyrB基因的LAMP扩增结果

3 讨论

溶藻弧菌是海水中最常见的优势弧菌，既是海水养殖动物的重要致病菌，也是多种人类疾病的致病菌，对水产养殖业以及人类健康有着重要影响[15]。目前，溶藻弧菌的检测主要是传统的微生物鉴定方法和常规的分子生物学方法。传统培养鉴定检测方法完成一个鉴定周期用时较长且步骤繁琐；常见的分子生物学方法如普通PCR、荧光定量PCR等不但需要PCR仪且对场地和人员的操作要求相对较高，不利于在条件相对简陋的条件下展开工作[16]。环介导等温扩增（LAMP）技术是由NOTOMI等[17]于2000年报道的一种核酸等温扩增技术，其原理是针对靶基因的6个位点设计2对特异性引物（内、外引物各一对），应用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA酶）通过链置换方式进行高效扩增，具有高特异度、高灵敏度、简便、快速、低成本及对仪器要求低的特点，已广泛应用于微生物、病毒、寄生虫等多种领域[18-19]。

本研究中通过在线软件针对gyrB基因设计了LAMP引物，首先将反应体系在不同温度条件进行反应，2g/dl凝胶电泳结果显示61℃的反应条件下扩增产物的条带最为清晰，效率较高；在确定了反应条件后我们对反应时间的长短进行了优化，2g/dl凝胶电泳结果显示在最佳反应温度下反应60 min的效果即能满足后续实验的要求并不需要延长反应时间来提高扩增效率。确定反应温度及反应时间后，我们对该方法的特异度和敏感度进行了评估。该体系在特异性检测中溶藻弧菌标准株和溶藻弧菌野生株扩增结果为阳性，其它菌株扩增结果为阴性，可以有效地对溶藻弧菌及其它6种常见致病菌进行区分，具有较好的特异度；在敏感度检测中当溶藻弧菌标准株核酸模板浓度为102～10-4mg/L时，每个浓度均出现阳性扩增条带，当模板浓度降低到10-5mg/L时未出现阳性条带，说明该体系检测的灵敏度为10-4mg/L。

综上所述，我们基于LAMP技术建立了一种以gyrB基因为分子靶点的快速、简便、准确的溶藻弧菌检测方法，对溶藻弧菌的快速检测具有重要意义。