PINK1/Parkin介导线粒体自噬对缺血性脑卒中作用的研究进展

靳晓飞 高维娟

(河北中医学院 河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室，河北 石家庄 050091)

脑卒中具有发病突然、起病急骤、致残率高和死亡率高等特点，尤其是60岁以上的老年人则具有更高的发病率和死亡率〔1〕。脑卒中主要包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中两大类，其中缺血性脑卒中的发病率和致死致残率不断攀升，占全部脑卒中的60%～80%〔2,3〕。缺血性脑卒中的发生机制十分复杂，涉及兴奋性氨基酸毒性、钙离子超载、炎症反应、细胞凋亡、线粒体功能障碍等，且这些因素相互影响相互联系，形成恶性循环，最终造成不可逆性脑损伤〔4,5〕。研究发现，线粒体功能障碍是缺血性脑卒中发生发展过程中的重要环节，因线粒体功能障碍所引起的线粒体自噬与缺血性脑卒中密不可分。

1 线粒体自噬与缺血性脑卒中

1.1细胞自噬的概念 自噬是指在自噬相关蛋白的调节下，由脱落的内质网膜或高尔基体膜与细胞内损伤的细胞器或异常的蛋白质相结合，形成双层膜结构的自噬小体，进而与溶酶体逐渐融合，形成自噬溶酶体，随后通过溶酶体酶降解其所包裹的内容物，从而实现组织细胞的代谢需要或某些细胞器的更新〔6〕。随着对自噬的深入研究发现，自噬包括多种形式，目前已发现至少有5种选择性自噬类型：线粒体自噬、内质网自噬、核糖体自噬、过氧化物酶自噬和异源自噬等。各个类型的自噬参与了机体的不同生理过程，在维持组织和细胞内环境稳定中发挥着非常重要的作用。

1.2线粒体自噬的概念和过程 线粒体自噬是指细胞通过自噬调控机制选择性清除损伤或功能障碍线粒体的过程，对于调节线粒体功能和维护细胞生存具有重要作用〔7,8〕。有研究指出，线粒体自噬的过程可分为两个阶段，即线粒体自噬“两步模型”〔9〕。第一阶段：受损或功能障碍的线粒体和自噬相关基因ATG上游调控蛋白集聚于自噬小体结合位点。线粒体受损后，其外膜调节蛋白将激活PINK1/Parkin调控的泛素化反应，泛素化的线粒体和自噬相关基因ATG上游调控蛋白与自噬小体结合位点发生耦联。该过程不需要隔离膜参与，同时也不依赖于微管相关蛋白1轻链(LC3)-Ⅱ；第二阶段：形成自噬小体。受损的线粒体被隔离膜逐渐包裹，形成具有双层膜结构的自噬小体，自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，被包裹的线粒体在溶酶体酶的作用下被降解利用。该过程不仅需要LC3-Ⅱ及连接LC3与线粒体的接头蛋白p62、optineurin、NBR1的参与，同时FUNDC1、Nix/BNIP3、SMURF1等在这一阶段也发挥了关键作用。线粒体自噬作为自噬的重要形式之一，在调控细胞内稳态、增殖、分化、遗传、衰老和死亡等细胞进程中发挥重要作用，是控制线粒体质量的重要机制。研究发现，线粒体自噬与阿尔茨海默病、帕金森病和亨延顿病等神经退行性疾病，心脑血管病、内分泌疾病、固有免疫疾病、恶性肿瘤等密切相关，且其在缺血性脑卒中的发生发展过程中更是扮演着不可替代的角色〔10〕。

1.3线粒体自噬在缺血性脑卒中的神经保护作用 线粒体作为“细胞的动力室”，不仅可以产生(ATP)为机体提供能量，而且在控制活性氧(ROS)产生、维持钙稳态、调节渗透压、转导细胞信号等方面均起着重要作用。缺血性脑卒中最直接的损伤是脑内能量供给急剧减少，同时引起线粒体的形态、结构和功能破坏，从而进一步加剧细胞能量代谢障碍。受损的线粒体在缺血再灌注期间还可产生大量ROS，加重氧化损伤，引起钙稳态失调，最终导致细胞死亡。缺血性脑卒中发生后，在引起线粒体损伤的同时也激活了线粒体自噬，线粒体自噬可通过及时识别和清除损伤的线粒体和异常的蛋白质，调节线粒体功能，控制线粒体质量，发挥神经保护作用〔11〕。

Zuo等〔12〕采用大鼠局灶性大脑中动脉闭塞法建立缺血性脑卒中模型，并通过腹腔注射葡萄糖模拟缺血性脑卒中发病后的高血糖状态，观察了线粒体自噬和高血糖对脑缺血大鼠的影响，发现轻度高血糖大鼠脑缺血损伤程度并不加重，而重度高血糖可通过抑制线粒体自噬，使清除受损线粒体的功能发生障碍，引起细胞能量代谢障碍和线粒体途径细胞凋亡损伤，神经功能缺损和脑梗死容积均明显加重，表明线粒体自噬可发挥神经保护作用。Zhang等〔13〕采用氧糖剥夺/复氧复糖法建立神经元体外缺血/再灌注损伤模型，应用特异性荧光染色对自噬小体和线粒体进行标记，发现模型组中自噬小体和线粒体的荧光标记大量重叠，而正常对照组中荧光标记重叠很少，表明线粒体自噬在氧糖剥夺/复氧复糖神经元中被明显激活。为进一步研究线粒体自噬在缺血性脑卒中的作用，Zhang等〔13〕采用小鼠短暂性大脑中动脉闭塞法建立在体缺血性脑卒中模型，并于缺血再灌注的同时给予自噬抑制剂3-MA侧脑室注射处理，发现与模型组相比，3-MA给药组小鼠脑梗死容积明显增加，同时自噬相关蛋白Beclin1和ATG7表达降低，自噬小体和线粒体荧光重叠明显减少，表明线粒体自噬在缺血再灌注期间发挥保护作用。Li等〔14〕通过建立大鼠短暂性缺血性脑卒中模型，于缺血再灌注的同时给予自噬激活剂雷帕霉素处理。结果发现，雷帕霉素给药组线粒体自噬明显增强，脑梗死容积和线粒体功能障碍均显著减轻，进一步证实了线粒体自噬对缺血性脑卒中可发挥神经保护作用。

2 PINK1/Parkin与线粒体自噬

目前研究，哺乳动物体内调控线粒体自噬的机制主要有两种方式：Parkin依赖性途径和Parkin非依赖性途径。其中，Parkin依赖性途径是指由线粒体外膜蛋白酶PINK1与E3泛素连接酶Parkin介导的线粒体自噬；而Parkin非依赖性途径主要是指由NIX/BNIP3信号通路介导的线粒体自噬和FUNDC1信号通路介导的线粒体自噬〔15，16〕。Parkin依赖性途径，即PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，作为调控线粒体自噬的经典通路，目前研究最为广泛也是研究最清楚的线粒体自噬信号通路，其在调控线粒体自噬和维持线粒体功能方面发挥着重要作用。

2.1PINK1的结构与作用 PINK1是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由581个氨基酸组成，在哺乳动物各组织器官中广泛表达，尤其在神经系统、心脏和骨骼肌中含量丰富。PINK1氨基酸序列根据其功能不同可分为四个区域：N端线粒体靶定信号肽、线粒体内膜转移终止信号肽、丝氨酸/苏氨酸激酶结构域、C端线粒体外膜滞留信号肽〔17〕。正常情况下，PINK1在线粒体外膜转运酶的作用下，由线粒体外膜不断被转移到线粒体内膜，被线粒体内膜上的早老素菱形蛋白(PARL)不断切割分解，因此正常线粒体中的PINK1表达较低，不容易被检测到〔18〕。但是，当线粒体受损，膜电位出现去极化时，PINK1不能被顺利转移到线粒体内膜，无法被相关蛋白酶降解利用，而是集聚在线粒体外膜，并将招募Parkin到受损线粒体。

2.2Parkin的结构与作用 Parkin是一种E3泛素连接酶，拥有465个氨基酸，根据其氨基酸序列功能不同可分为五个区域：N端泛素样结构域、RING0结构域、RING1结构域、RING1与RING2之间的IBR结构域、RING2结构域。其中，N端泛素样结构域的功能主要包括识别细胞基质、结合SH3、联合蛋白酶体、调节泛素蛋白和Parkin活性等〔19〕。正常情况下，Parkin主要通过两种调控机制维持自身稳定状态：①在RING2结构域和IBR结构域之间存在抑制序列，即Parkin抑制因子，该抑制因子可阻断E2结合位点与RING1结构域之间的联系；②RING0结构域将位于RING2结构域上的泛素蛋白酶结合位点半胱氨酸遮盖起来，半胱氨酸无法发挥催化作用，从而维持Parkin自身稳定抑制状态。当线粒体受损时，Parkin的空间结构发生变化，半胱氨酸暴露，催化作用启动，Parkin获取磷酸化催化活性，活化的Parkin可催化位于线粒体外膜和胞质中的蛋白质引起泛素化修饰，泛素化的线粒体在多种自噬相关蛋白的调节下，被具有双层膜结构的自噬囊泡包裹，形成线粒体自噬小体，随后线粒体自噬小体与溶酶体逐渐融合，形成线粒体自噬溶酶体，被包裹的受损线粒体在溶酶体酶的作用下被降解和利用，从而维持细胞内环境的稳定〔20～22〕。

2.3PINK1/Parkin介导线粒体自噬对缺血性脑卒中的作用 大量研究证实，PINK1和Parkin在同一条基因通路上发挥作用，PINK1位于Parkin上游，二者相互作用可诱导线粒体自噬的发生〔23～25〕。缺血性脑卒中引起线粒体损伤时，PINK1作为受损线粒体的分子探测器，可及时感应受损线粒体膜电位的下降，稳定集聚在线粒体外膜，招募Parkin转位到受损线粒体，诱导线粒体自噬发生，使受损线粒体被线粒体-自噬-溶酶体途径降解和利用〔24,26〕。另外，PINK1和Parkin之间相互作用并保持着相对平衡，该相对平衡作用在重建线粒体膜电位、提高信号传导效率、防止线粒体自噬过度引起自噬性损伤，建立严格的线粒体质量调控机制等方面具有重要意义〔27，28〕。

Safarpour〔29〕应用缺血性神经元，初步观察了PINK1和Parkin在缺血性神经元中的作用。研究发现，敲除PINK1或Parkin基因均可引起神经元兴奋性氨基酸毒性反应，PINK1和Parkin任一基因缺失均可加重神经元损伤，提示PINK1/Parkin对缺血性脑卒中可能发挥着重要作用。Wu等〔30〕应用大鼠海马神经元通过氧糖剥夺/复氧复糖法建立缺血性脑卒中细胞模型，在离体细胞水平，观察了H2、自噬激活剂雷帕霉素、自噬抑制剂3-MA对氧糖剥夺/复氧复糖大鼠海马神经元的影响，探讨了PINK1/Parkin信号通路介导线粒体自噬在缺血性脑卒中的保护作用。结果发现，H2和雷帕霉素均可提高细胞活性，抑制ROS水平和细胞凋亡率，而经3-MA处理后的神经元，其细胞活性明显降低，ROS水平和细胞凋亡率明显上升；随后，进一步观察了线粒体膜电位(MMP)和线粒体自噬情况，发现H2和雷帕霉素对MMP的丢失有保护作用，同时可增加线粒体与GFP-LC3的共定位，提示线粒体自噬的发生，而3-MA则具有相反的作用；最后，检测了线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、PINK1和Parkin的表达，发现H2和雷帕霉素可显著诱导氧糖剥夺/复氧复糖大鼠海马神经元LC3-Ⅱ、PINK1和Parkin的表达，而3-MA可抑制LC3-Ⅱ、PINK1和Parkin的表达，表明PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在氧糖剥夺/复氧复糖大鼠海马神经元中可发挥神经保护作用。Rui等〔31〕采用大脑中动脉闭塞法建立缺血性脑卒中大鼠模型，在动物水平，观察了缺血性脑卒中大鼠脑梗死体积及LC3、Beclin1、LAMP-1、PINK1和Parkin的表达水平，探讨了PINK1/Parkin信号通路介导线粒体自噬对缺血性脑卒中大鼠的作用。研究发现，大鼠脑缺血再灌注不同时间点均可导致大脑中动脉区域梗死，并伴有全脑损伤；LC3B、Beclin1和LAMP-1再灌注后表达不断上调，并在再灌注24 h达到高峰；此外，再灌注24 h时线粒体外膜PINK1表达明显增加，Parkin线粒体易位增加；而当给予PINK1抑制剂处理后，大鼠脑梗死体积明显增加，Parkin线粒体易位减少，LC3B、Beclin1和LAMP-1表达降低。该研究结果进一步证实了PINK1/Parkin信号通路通过介导线粒体自噬参与了缺血性脑卒中的病理生理过程，并且在其中发挥保护作用。

因此，PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬在缺血性脑卒中的发生发展过程中发挥着不可替代的作用。如果能够准确调控PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，很可能会找到防治缺血性脑卒中新的治疗靶点和作用机制。

3 小结与展望

缺血性脑卒中是危害人类健康的常见病，特别是60岁以上的老年人具有更高的发病率和死亡率，如何有效降低缺血性脑卒中的发病率和死亡率已经成为临床上亟待解决的客观难题。缺血性脑卒中发生后，可严重破坏线粒体的形态、结构和功能，引起细胞能量代谢障碍，甚至引发恶性级联反应。线粒体自噬在缺血性脑卒中发生后可以应激性被激活，及时清理受损线粒体和功能异常的蛋白质，维持细胞内环境稳态，发挥神经保护作用。PINK1/Parkin是介导线粒体自噬的关键通路，在调节线粒体自噬和维持线粒体质量等发面发挥着重要作用。PINK1作为受损线粒体的分子探测器，能够准确识别线粒体受损，引导Parkin转位到受损的线粒体，激活PINK1/Parkin和自噬相关信号通路，诱导线粒体自噬的发生，使受损的线粒体被线粒体-自噬-溶酶体途径降解和利用，最终达到拮抗缺血性脑卒中的目的。然而，随着对线粒体自噬和缺血性脑卒中的不断深入研究发现，线粒体自噬是一把“双刃剑”，其在缺血性脑卒中的作用可能与脑缺血时间、缺血程度及再灌注不同病理过程密切相关，过度线粒体自噬可引起自噬性细胞损伤，加重缺血性脑卒中〔32,33〕。因此，如何更加精准地调控PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，甚至应用某些药物进行干预，充分发挥PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在缺血性脑卒中的神经保护作用，将是我们进一步努力研究的方向。