光谱技术检测乳制品品质的研究进展

伍琳琳，蒋萍萍，杨洋，贝君，孙利

（中国检验检疫科学研究院，北京100176）

0 引言

乳制品需要经历多个加工步骤才能被消费，使其容易受到掺假和污染，加上乳制品本身成分复杂，给检测带来很大难度。国家标准中大多采用化学方法，其精度最高。但随着乳制品消费量急剧增长，面对大通量的检测要求，化学方法成本高耗时长的缺陷日益突出。为了寻求快速准确的检测方法，国内外学者做出了很多努力。从19世纪60年代起，实用光谱学逐渐迈向食品领域，并逐步得到人们认可。Kawamura最早用光栅光谱仪等构建了牛奶品质的在线检测系统，Okazaki使用便携式拉曼光谱仪检测牛奶中三聚氰胺；国内韩东海、杨仁杰、陈达、刘欢等[1-4]使用近红外光谱、二维相关红外光谱、拉曼光谱及荧光光谱等不同手段进行了相关专项研究。但大多数成果限于一种牛乳成分或单一检测手段，鲜见多成分多手段的全面论述，故本文作者在参考国内外专业文献的基础上，并结合自身实验感悟总结出检测乳制品特定成分的最佳手段，是对现有手段的良好补充，实现了“因料施法”的目的。

1 检测手段

振动光谱可以从简单的识别到深入的定性和定量分析，它依据的基础信息是分子等微观粒子运动的特征，分析过程承载的分析信号是待测样品的光谱。依据样品的光谱特征，通过对光谱参数与待测量之间的数学关系即数学模型来实现分析。分子振动可能引起固有偶极矩的变化，也可能引起极化率的变化，这两种变化可以分别产生红外光谱和拉曼光谱。其中，红外吸收位于近红外和中红外区。近红外光谱主要反映含氢基团的倍频及合频吸收，中红外和拉曼均反映分子振动的基频信息。在欧美等国，分子光谱技术已成为乳制品成分分析的重要手段，并为乳品权威分析机构，如国际乳品联合会（IDF）及美国分析化学家学会（AOAC）等权威机构所认可。另外电子光谱中的荧光光谱以其高灵敏（灵敏度常可达10-12～10-9）的检测优势，在牛乳成分检测中异军突起。这4种技术在乳制品检测中都有各自的亮点与不足。目前较为成熟、应用比较广泛的牛乳成分分析仪是基于中红外光谱技术设计研制，利用该原理制造的仪器中，以丹麦FOSS公司的MilkoScan系列仪器为典型代表，这种仪器已在国内的大型乳制品企业使用，效果较为理想。但是该仪器价格比较昂贵，在中小型企业中的普及率不高，另外通常需要样品前处理，不利于在线检测。近红外光谱和中红外光谱原则上非常相似，但近红外较中红外光程短，在常规光纤中具有良好的传输特性，故前处理相对简单且仪器价格相对较低。乳品中的常规成分蛋白、脂肪、总固形物等在近红外区都有特定的吸收，虽然信号强度比中红外反映的基频信息信号弱，但采用合适的化学计量学方法能较好地解决这一问题。加上近红外光谱在测样方面的独特优势，能在短时间内同时检测多种乳品成分，使近红外光谱在乳品成分在线检测领域比中红外光谱更具优势，故本文将不再论述中红外光谱技术在乳品工业中的应用，将重点论述其他3种光谱技术在乳品检测方面的独特潜力及技术优势。

1.1 近红外光谱

在鲜牛奶收购过程中，近红外光谱可以快速测定鲜牛奶中的蛋白、脂肪、乳糖、体细胞和尿素氮等含量，这不仅可以为牛奶后续生产过程中的质量提供保障，也为奶牛群体改良（Dairy Herd Improvement，DHI）又称“奶牛生产性能测定体系”统领奶业发展提供技术支撑。如Kawanura等[5-7]最早利用光栅光谱仪等构建牛奶品质的在线检测系统，对非均匀状态下的牛奶中各成分指标进行预测；李晓云[8]采用便携式短波近红外仪大光斑漫反射附件采集牛奶样品光谱，建立了牛奶中脂肪、干物质的定量分析模型，模型稳定且具有良好预测精度(脂肪r=0.98，RPD=5.02；干物质r=0.98，RPD=3.20)。同样采用漫反射方式及偏最小二乘建模方法，张中卫等[9]建立了奶粉中蛋白质、脂肪的定量模型（蛋白质R2=0.987，RMSC=0.385；脂肪R2=0.986，RMSC=0.419），模型达到实用化要求。高云天[10]采用近红外光谱仪和乳成分分析仪对比分析了牛奶中的蛋白和脂肪，结果表明两者无显著差异，而近红外光谱仪方便、快速、高效，更具优势，可代替乳成分分析仪来检测牛奶中的蛋白、脂肪。Elainy等[11]的工作也证实了近红外光谱是一种能定量检测乳蛋白及乳脂肪的快速、有效手段。这些实验结果均表明，近红外光谱在测量乳和乳制品成分方面优于其他分析测定方法。

在乳制品加工过程中，近红外光谱可以实时监控酸奶发酵过程中的酸度，防止牛奶过度发酵，控制产品的质量。Navrati等[12]利用近红外光谱(NIR)测定技术和电子鼻技术(EN)对工厂条件下生产的酸乳酪和酸奶的发酵进行监控，对NIR和EN信号进行主成分分析，其第一主成分用来解释实际发酵进程，之后对光谱信号进行偏最小二乘建立PH和可滴定酸含量预测模型。结果表明，两种技术联用可以实时监测和评定酸奶发酵过程中的产品品质；固体脂肪含量（SFC）是奶油、黄油等乳制品生产过程中的常规检测指标，它对奶油及黄油成品的口感、香味及涂抹性有很大影响。自20世纪60年代以来，核磁共振（NMR）作为一种可靠的手段来测定固体脂肪含量。但直接NMR方法需要三个标准样品（0%SFC，30%低SFC，70%高SFC）作对照，且样品预热时间长，限制了分析速度。于是Meagher等[13]尝试利用FOSS 6500近红外光谱仪对奶油生产过程中乳脂固体脂(SFC)含量进行检测，因为SFC对温度及其敏感，故配备标准控温附件采集样品，使整个实验过程中样品温度保持在60℃，得到模型SEP值在0.385%～0.762%之间，且能在几秒之内完成测量，指出近红外有望代替核磁共振成为检测SFC含量的手段；奶酪制作过程中牛奶凝结的失败会直接导致产品品质不佳、产量下降，故监测牛奶凝结过程在奶酪制造中十分关键。Grassi S等[14]提出了一种基于FT-NIR光谱的过程分析技术方法，采用多元曲线分辨-交替最小二乘（MCR-ALS）用于数据分析，建立的模型很好地描述了凝结过程（解释方差≥99.93%；拟合度＜0.63%；残差的标准偏差＜0.0067），并证实了光谱技术对凝结现象的敏感性更高。实验表明，将FT-NIR光谱与MCR-ALS数据精细化结合可以用于奶酪制造过程中对牛奶凝结的在线监测。

在乳制品掺假鉴定方面，近红外光谱也发挥一定作用。上世纪90年代，Sumio Kawano等[15]人使用近红外光谱发现1164 nm，1660 nm，2144 nm，2176 nm处的吸光度值与植物油掺加比例有很强的相关性，并得出黄油中掺加人造奶油的最小检出掺加量为3%；除了植物油，植物性蛋白也被掺加到乳制品中。Maraboli等[16]应用傅里叶近红外光谱仪InfraAlyzer 500对乳粉中分别出掺入小麦、大豆、豌豆等植物性蛋白进行了定量预测，对添加植物蛋白浓度0～5%范围内的所有样品进行校准，未包含在校准集中的样本形成单独的预测集和验证集。通过对五个波长的吸光度值的一阶导数进行多元线性回归（MLR），获得最佳结果。校准曲线的回归系数R2为0.993，SEC为0.20，SEP为0.23，SEV为0.21，证明了近红外光谱是鉴别奶粉中掺加植物蛋白的非常有效的工具。除此之外，水、乳清、奶粉等常规掺假物也能被近红外光谱检出[17-18]。

相比于中红外来说，牛乳对近红外谱区吸收较弱，近红外更容易进入牛乳内部获取多种成分信息，更适于做乳品成分的旁线检测及在线监测，控制基本实现实时性。但由于有机物在近红外谱区各级倍频和合频的吸收强度大体上依次比基频或者上一个倍频低一个数量级，信息强度降低，谱峰强度减弱，使近红外测量的检出限比中红外的检出限低一至几个数量级，它对天然产物的最低检出限为0.1%。牛乳中三聚氰胺、抗生素等浓度都较低，有些接近近红外的最低检测限，增加了准确预测的难度。此时，拉曼技术就能派上用场。

1.2 拉曼光谱

拉曼光谱是一种产生于分子或者晶格振动能级的光子的非弹性散射光谱，拉曼光谱特征峰位置、强度和线宽可提供分子振动、转动方面的信息，据此可以反映分子中不同的化学键和官能团。它以其强大的分子结构指认功能，成为测量牛乳中共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）含量的最佳方法：共轭亚油酸是人体不可缺少的脂肪酸之一，牛乳是人们获取CLA的主要途径。Meurens[19]使用拉曼光谱指认出牛乳CLA分别在1652 cm-1、1438 cm-1、3006 cm-1有特征拉曼信号，并得出此三个特殊信号能准确可靠得检测出牛乳脂肪中的CLA含量。

相对于红外光谱，拉曼光谱的测量范围宽，通常为4 000～40 cm-1，无机化合物的拉曼光谱信息量要比红外光谱多，且谱峰比较尖锐，故识别无机混合物要比红外光谱更容易。但拉曼信号通常是非常弱的，每106～108光子中只有一个会发生非弹性散射，此时需要用到表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS)，它将分子吸附到某些粗糙金属如金、银或铜的表面，两者发生相互作用，可使拉曼信号强度增加104-106倍。天然牛乳中的硫氰酸钠（NaSCN）是一种无机化合物，它是牛奶中过氧化物酶抗菌体系（LPS）的主要成分之一，能够抑制和杀灭各种微生物，达到非冷却条件下牛乳保鲜的目的，但它影响人体碘代谢易造成甲状腺肿大，对孕妇、儿童及缺碘人士尤其有害。由于冷链储运的发展，2008年卫生部规定在乳制品中不允许添加硫氰酸钠作为防腐剂。张正勇等[20]将多层琼脂糖镀膜的微芯片结合纳米银粒子制成SERS活性基底用于便携式拉曼光谱仪检测牛奶中的硫氰酸钠，一般情况下纳米银溶胶的聚集程度难以控制，拉曼信号的重现性差。利用琼脂糖镀膜微芯片使硫氰酸钠分子均匀分散在其中，提高了基底稳定性。与传统拉曼光谱相比，其检测更灵敏，结果更准确，检出限为5×10-7g/mL，分析过程绿色环保且能同时检测16个样品，非常适用于牛奶中硫氰酸钠现场检测。

2008年，“三鹿事件”发生之后，三聚氰胺的检测标准被提上日程，其中高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/质谱法成为原料乳及乳制品中三聚氰胺检测的国家标准，但面对高通量、大范围的检测需求，其成本高耗时长的缺陷日益突出。拉曼光谱能够做到三聚氰胺无损快速检测，是国标方法的极好补充。其中Okazaki[21]最早使用小型便携式拉曼光谱仪检测系统牛奶中三聚氰胺，指出676 cm-1是鉴别三聚氰胺的特征拉曼位移，并在不富集的情况下，测得其检出线为1%；Lou等[22]进一步采用4-巯基吡啶（MPY）修饰的金纳米基底对奶粉中三聚氰胺进行检测研究，将一定量的三聚氰胺掺入至奶粉中，纳米金与三聚氰胺迅速结合使MPY结构发生变化。这种变化在SERS光谱上有规律地反映出来，从而达到拉曼信号增强的目的。实验证明该法可快速检测到奶粉提取液中0.5 ppb的三聚氰胺。目前，在中国三聚氰胺激光拉曼光谱检验仪已应用在各大乳制品企业的奶站和基层工商所、质检所，其单次检验成本仅10元，快速可靠的检测使三聚氰胺无可逃遁。截至2015年，1054个参测牛场中生鲜乳三聚氰胺检测合格率已连续7年保持100%[23]；

青霉素是中国畜牧业使用最多的抗生素。由于细菌耐药性增强，奶农超量添加青霉素并同时加入β-内酰胺酶使其转化为青霉酸（penicilloic acid，PA）来掩盖此不法行为。PA作为青霉素的降解产物，仍会残留在牛奶中从而引起过敏反应。因此，非常有必要检测乳制品中的痕量PA。当前对牛奶中PA的测量主要依靠酶联免疫吸附测定（ELISA）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）。但它们需要样品预处理、费时且成本高。Meihui QI等[24]成功地开发了一种无标记SERS方法来识别和检测乳制品中的PA。研究表明，具有26 nm金核和9 nm银壳层的Au@Ag纳米颗粒具有宽而强的等离子体共振吸收，其拉曼增强效应主要来自于相邻纳米颗粒的热点，在这些热点中，目标分子（PA）本身作为分子连接剂直接诱导Au@Ag纳米颗粒的聚集，而不需要外加电场特定聚合剂的辅助作用。同时，采用智能Au@Ag-NPs作为SERS传感器，在LOD分别为3.00、3.00和4.00 ppm的情况下，实现了对液态奶、酸奶和奶粉中PA的直接检测，加标样品的回收率在96.0%～103%之间。与以前的方法相比，SERS技术非常简单（没有任何样品预处理，例如离心、提取和分离过程），每项试验只需要10μL的样品，在3 min内完成。因此无标记SERS方法更适合于乳制品中PA的快速现场筛选。

在拉曼光谱测试中，荧光是其最大干扰，是影响定量和定性分析的主要因素之一。由于牛乳中含有荧光物质如维生素、美拉德产物等，当用激光光束照射时，产生的强荧光背景会将拉曼信号湮没，加上其含量微小，在测定这些物质时，使用荧光光谱分析更为恰当。

1.3 荧光光谱

荧光光谱分为分子荧光光谱和原子荧光光谱。分子荧光指物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最低振动能级返回基态时所发射出的光。在传统荧光光谱中，为了消除入射光与散射光的影响，一般使激发光与发射光呈90°。但对于牛乳这种吸光度大于0.1的样品，发射光透出会遇到很大阻碍，若继续沿用传统方法需要对牛奶进行酸化、离心、稀释、过滤等处理，无法满足在线检测的要求。1968年Parker尝试将角度改为56°，即为后来沿用至今的前表 面 荧 光 法（front-face fluorescence spectroscopy，FFFS），该方法增大了样品光照面，减小了散射作用，省去了不透明物质的前处理步骤，十分适合乳制品快速检测[25-26]。

本身能够发射荧光且能形成荧光测量体系的物质相对较少，有机物中以芳香性结构的大分子杂环类物质为主：维生素A是脂溶性维生素，在奶酪成熟过程中，甘油三酯黏度变化、结晶形成等使维生素A周围环境发生变化，这种变化在荧光光谱中显示为308 nm、322 nm处的谱峰向长波方向移动。R.Karoui[27]利用这种变化，结合主成分分析（(Principal Component Analysis，PCA）和因子判别分析(factorial discriminant analysis，FDA)监控半硬质奶酪的成熟过程，取得了良好效果；Becker[28]利用标准AOAC荧光分析法检测原味酸奶中的核黄素。散射光干扰是提高其灵敏度的主要限制因素，为得到准确结果，进行多次空白测定，对散射光的影响进行校正，进而得出荧光光谱与核黄素含量之间的相关系数为0.99，建立偏最小二乘回归模型得到的相关系数为0.97。又因为核黄素在奶制品光氧化中发挥关键作用，可作为奶制品早期氧化的标志物，进而能够监控牛乳腐败；当人们加热生奶，企图杀灭其中的致病菌、继而希望彻底杀灭所有细菌时，殊不知高温会导致牛奶中乳蛋白和乳糖发生美拉德反应（Maillard reaction）而产生对人体有害的物质。早在上世纪末，研究者们就发现荧光光谱能够检测牛乳加热时的品质变化：1996年Morales[29]在试管中加热牛奶并用荧光光谱测出牛奶的动能值；1997年Dufour[30]利用FFFS区分均质、加热后的牛奶；1998年Birlouez[31]又引进“高级美拉德产物与可溶性色氨酸的荧光特性”（Fluorescence of Advanced Maillardproducts and Soluble Tryptophan，FAST）监控牛奶加热进程。因FFFS对牛乳加热过程的敏感性及不需任何前处理的优势，成为在线监控牛乳加热品质的最佳手段，并已作为过程分析技术（process analytical technology，PAT）应用于实际生产当中[32]。

原子荧光是指基态原子(一般为蒸汽状态)吸收合适的特定频率的辐射而被激发至高能态，而后以光辐射的形式发射出特征波长的荧光。据此原理，氢化物发生技术(HG)与原子荧光光谱(AFS)相结合形成HG-AFS分析技术：砷、锗、硒、汞等元素的氢化物具有挥发性，借助载气流导入原子化器或激光光源中，从而进行原子光谱的定量测量。由于这些元素的主要荧光谱线恰是日盲光电倍增管灵敏度的最好阶段，且能与基体分离，大大降低了基体干扰，使HG-AFS在该方面有其他技术难以达到的灵敏性与准确性[33]，加上其仪器结构简单无需分光设备，价格低廉，对利润较低的食品业有很大优势。GB 5009.93-2010食品中硒的测定、GB/T 5009.11-2003食品中砷的测定和GB 5009.12-2010食品中铅的测定均使用该法；吴平[34]探索原子荧光光谱法对牛奶中铅含量的测定，前处理采用免消解的酸蛋白沉淀法，并在体系中加入硼酸形成缓冲试剂，从而满足了HG-AFS测铅时对环境酸度的苛刻要求，提供了快速可靠无污染的检测方法，完成能够适应企业需要；Patricia[35]还建立了悬浮体进样法同时检测乳中砷、硒、锑、碲、铋的氢化物发生原子荧光法，As、Sb、Se、Te、Bi的检出限分别为2.5 ng/L，1.6 ng/L，3 ng/L，6 ng/L，7 ng/L，使HG-AFS技术在该领域大放异彩。

2 光谱检测所面临的挑战

（1）近红外光谱技术的重大挑战是建立稳健的模型。建立的模型必须经过认真的系统设计和验证，否则所建立的模型极易受样品基体的影响，如牛乳样品的乳脂肪球粒度、密度等都对其结果产生影响，而系统的设计和验证工作通常需要大量的时间、精力和资金；仪器设计缺少一致性是近红外光谱技术另一个重要问题。由于仪器零件不精密，仪器之间存在台间差，将极大限制近红外技术的推广和应用；

（2）表面增强拉曼光谱虽然能检出牛乳中微量痕量物质，但用于定量分析还有很长的路要走，因为目前没有其他技术保证SERS定量分析的可靠性。SERS的定量分析首要解决的是增强基底的均一性和可靠性。纳米材料不同位点的增强效应不同，粒子靠近，耦合和增强效应就强，反之就弱；另外一个关键问题是检测方法的选择性。像牛奶这样的复杂体系，SERS将获得大量待测分子和干扰分子的信息，如果没有优异的选择性，则无法筛选出待测分子的信号；另外，增强剂的保质也很重要，放置一段时间后，一旦增强剂变质，再高再均一的增强衬底都没有意义；

（3）原子荧光光谱仪是国产自主知识产权科学仪器中的佼佼者，但其一直以来的用户几乎都是大陆上的中国企业，无法走向国际市场。原因是原子荧光检测具有一定的局限性，如备受关注的铅，虽然能够测定，但对反应体系酸度、载气流量、屏蔽气流量等要求非常苛刻；另外，原子荧光光谱理论体系远不如原子吸收光谱成熟。现阶段，美国和欧盟只承认原子荧光测汞的方法，其他元素在理论体系的构建及推广方面还有待提高。

3 结果与展望

近红外光谱技术能够实现乳制品在线检测，在牛乳成分检测及常规掺假中发挥重要作用，制约其大规模推广应用的主要瓶颈在于模型数据库的建立与维护，需要组建行业的建模中心，围绕仪器选型、实验方法优化与规范化、建模算法与攻略、网络化运行等方面做扎实的基础研究和系统的技术开发等工作。随着我国乳品行业的发展，近红外光谱分析技术必将逐步取代目前在国内占主流的传统化学分析方法，在乳制品行业发挥越来越大的作用。另外，随着有关近红外相关标准[36]的逐步引入，未来近红外技术在乳品行业也必将像饲料、粮油和纺织等其他行业有章可依、有据可鉴；拉曼技术偏向于分子结构解析及微量痕量有害物质检测，小型化是拉曼仪器未来发展方向之一，实现精准的定量检测是站在该技术制高点的关键；荧光光谱在检测荧光物质时有着极高的灵敏度且不可替代的检测优势，开发可以在现场进行分析和在线检测的便携式HG-AFS分析仪器是当前的重要研究课题，也是未来原子荧光发展的重点。

这三种光谱在乳制品品质检测中具有极大优势和发展空间，几种光谱联用，再结合现有的理化方法，能够基本满足目前国内对大通量乳制品的检测需求，从而保证产品品质。