生鲜乳中嗜冷菌检验的两种培养条件比较

吉玲

（上海旺旺食品集团有限公司，上海201103）

0 引言

牛乳营养丰富，同时也是微生物的良好培养基，属于高营养易腐败的食品。嗜冷菌是影响牛乳保质期的主要因素。嗜冷菌在原料乳低温储存运输过程中可大量繁殖，其经过巴氏杀菌或UHT灭菌可以被杀灭，但其产生的耐热酶[1]经过热处理后仍然残留。这些耐热酶在乳制品储藏销售过程中被激活，会分解蛋白、脂肪，从而导致乳制品发生感官变化，出现脂肪上浮、蛋白沉淀、苦味、脂肪氧化味[2]等现象，给乳品品质造成较严重的不良影响。并且，嗜冷菌产生的耐热酶使乳品中蛋白、脂肪等成分稳定性下降，加工过程中易在设备管路内表面结垢，尤其是导致板式热交换器板片结垢严重，需要增加清洗强度及频次，从而增加设备清洗成本及产能降低。生鲜乳中嗜冷菌的检测和管控很有必要，并且也被国内外乳品企业及研究单位所关注。生乳中的嗜冷菌种类繁多，有细菌、放线菌、霉菌、低温藻类等。细菌是数量和种类最多的一类，涉及30多个属[3-11]。所以，嗜冷菌快速计数方法面临针对性和全面性两个挑战性问题。低温培养法是能筛选出嗜冷菌，较全面计数的较准确的方法。本实验参照SN/T 2552.4-2010[12],通过大量对比实验数据，比较了6.5℃10 d菌落计数[13]和21℃培养25 h菌落计数结果的差异，确认21℃培养25 h的嗜冷菌快速计数方法能否替代6.5℃培养10 d的计数方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

MLS-3751L-PC高温高压灭菌釜，日本三洋；lab dancer旋涡振荡器，IKA；CA-1390-1超净工作台，上海上净；SHP150生化培养箱，上海精宏；Galaxy 230菌落计数器，美国Sciencetool；HWS 12恒温水浴锅，上海一恒；DHG-9240A恒温干燥箱，上海一恒。

乳平板计数琼脂MPC，北京陆桥；磷酸盐缓冲液，北京陆桥。

山东旺旺食品有限公司收购的生鲜乳，抽取样品数90个，编号sample1、sample2、sample3、……、sample90。比对实验分6日完成，每日实验样品数为15个。

1.2 实验步骤

样品稀释：根据以往生鲜乳验收嗜冷菌检测实验数据，收购的生鲜乳嗜冷菌含量一般在101～105CFU/mL范围，故实验取10-1、10-2、10-33个稀释度的样液接种。第一步稀释，充分振荡混匀初始生鲜乳样品原液，无菌吸取样品25 mL，加入225 mL的无菌磷酸盐缓冲液中，充分振摇混合均匀，稀释成10-1稀释度的样液；吸取10-1稀释度样液1 mL，加入9 mL无菌磷酸盐缓冲液中，旋涡振荡制成10-2稀释度；吸取10-2稀释度样液1 mL，加入9 mL无菌磷酸盐缓冲液中，制成10-3稀释度的样品匀液。

接种：10-1、10-2、10-3稀释度，每个稀释度接种4个平皿，每皿加样1 mL，每皿倾注冷却至46℃的无菌MPC培养基15 mL～20 mL。

培养：待琼脂凝固干燥后，每个稀释度2个平皿倒置于6.5±0.5℃生化培养箱培养10 d；另外2个只平皿倒置于21±1℃生化培养箱培养25 h。菌落观察计数，选取菌落数在10～300 CFU内的平板计数，计算样品中嗜冷菌含量。

2 结果与讨论

2.1 实验结果

90个生鲜乳样品，经6.5℃培养10 d，21℃培养25 h，分别计数，计算嗜冷菌浓度。其中75个样品，即83.3%比例的样品，6.5±0.5℃10 d培养计数结果的对数值与21℃25 h培养计数结果的对数值之差的绝对值＞0.5 log10[14]，最大差异3.88 log10。

90个样本中88个样本，即97.8%比例的样本，21℃25 h培养计数结果高于6.5℃10 d的计数结果，如下图1所示。

图1 生鲜乳6.5℃，10 d计数与21℃，25 h计数结果

6.5 ℃培养10 d，21℃培养25 h两种条件培养计数结果之对数值，应用CORREL函数[15]，求得其相关系数仅为0.30；依两种培养条件计数结果之对数值的相关方程为y=0.8377x-0.7552，相关系数的平方R2=0.0907，如图2所示。由此可以看出6.5℃培养10 d、21℃培养25 h两种条件培养计数结果为非相关性。

2.2 分析讨论

图2 生鲜乳6.5℃，10 d与21℃，25 h计数结果相关性

据本次实验中90个生鲜乳样本嗜冷菌检测结果，6.5℃培养10 d计数与21℃培养25 h计数结果存在显著差异（P＜0.01），因为两种温度条件可培养出的嗜冷微生物的种类不同。21℃培养25 h计数结果高于6.5℃培养10 d计数结果，可能因为21℃条件下除了专性嗜冷菌可生长，一些兼性嗜冷微生物也可被培养筛选出来。所以，两种条件培养计数结果也不存在相关性。

乳品企业对生鲜乳中嗜冷菌监测时，可根据实际需要选择相应的培养计数方法。若为了保障乳品品质，确保安全卫生，则可选择21℃培养25 h计数的方法，该方法具有较大的包容性，可检出较大范围种类的嗜冷微生物群；若除了保障乳品的安全卫生，同时还需要研究和确认其实际专性嗜冷菌含量水平，以分析专性嗜冷菌含量与加工工艺及成品货架期内品质的相关性，则选择6.5℃培养10 d计数的方法可能更有意义。另外，乳品企业也可以在不同收购、储存、加工等不同的管控环节，选择相应的培养温度时间进行嗜冷菌计数，例如，对于牧场生乳嗜冷菌含量检验时，则选择21℃培养25 h计数的快速方法，有利于更迅速地评估各奶户的生乳卫生状态，以便发现问题，及时反馈，便于奶户尽快改善。对于巴杀前奶仓中生乳混合奶样的嗜冷菌检测采用6.5℃培养10 d或6.5℃10 d与21℃培养25 h同步培养的实验方案。

3 结语

生鲜乳中微生物含量的高低反映了其品质的优劣，为了保障消费者安全和健康，及降低乳品加工企业的经济损失，对生乳原料中的嗜冷微生物的检测及控制是有必要的。生鲜乳中嗜冷菌含量高时，在储运过程继续大量繁殖，则会产生大量的耐热酶类，导致乳中蛋白、脂肪、乳糖等营养成分分解，从而使UHT工艺过程面临较大的挑战，也会影响货架期内产品的风味、稳定性。乳品企业期望嗜冷菌能作为常规验收项目，但现行的培养计数技术需要的检测周期至少25 h，不适用于生鲜乳的实时验收。所以乳品行业迫切需要一个精确可靠，灵敏度高的，可操作性高，且成本低的，好的嗜冷菌快速检测方法。