多靶向嵌合抗原受体T细胞在恶性肿瘤中的研究进展*

舒琳倩 李琳 王雪娟 侯宗柳 王晓丹 综述 廖力微 审校

2018年全球最新癌症数据统计显示，中国新增恶性肿瘤病例430 万例，新增死亡病例290 万，中国癌症发病率和死亡率居全球第一［1］。恶性肿瘤治疗分为：手术、放疗、化疗、免疫治疗。其中免疫治疗有特异性强，不良反应轻等优点。嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）T细胞治疗是一种快速发展的免疫治疗方法［2］。CAR-T 细胞治疗是从癌症患者中分离出T 细胞，在体外通过基因技术构建CAR，并实现扩增后回输给患者，CAR-T 细胞直接靶向杀死肿瘤细胞并刺激机体的免疫反应［3］。目前国内外单靶向CAR-T 细胞在血液肿瘤中的治疗效果较好，但靶抗原的丢失也是使用单靶向CAR-T细胞治疗后肿瘤复发的主要原因之一［4-5］。如抗CD19和CD22的CAR-T 细胞治疗后，单靶向CAR 通过靶抗原表面表达的丢失或减少导致肿瘤免疫逃逸［6-7］。然而，多靶向CAR因为能够同时靶向多个肿瘤抗原从而降低肿瘤免疫逃逸的可能，已用于临床恶性肿瘤研究。多靶向CAR 包括2 个或2 个以上的单链抗体（single chain variable fragment，scFv）区域，其排列成串联或环状结构，每个区域针对一个不同的抗原，并且每个抗原有使CAR激活的能力［8］。研究表明，同时针对多种抗原构建的多靶向CAR-T细胞治疗可以产生协同效应，并有助于克服因单一可变抗原丢失发生的复发［5］。多靶向CAR-T 细胞治疗是最近肿瘤研究的热点，众多恶性肿瘤的研究突破均与其相关，它是恶性肿瘤靶向治疗的主要方式，也是攻破癌症复发的关键措施之一。

1 多靶向CAR-T的概念及效应机制

多靶向CAR-T 是赋予T 细胞多抗原特异性，允许scFv区域结合2个及以上的特异性肿瘤抗原，并均可触发完整的CAR 信号并驱动T 细胞活化、增殖和发挥细胞毒活性。目前通过下述4 种方法可实现多靶向CAR-T 的效应机制：①产生2 个或更多表达不同CAR 的细胞群并将其一起或顺序地注入体内；②使用双顺反子表达载体，在同一细胞上编码2个不同CAR；③同时设计2 种不同结构的T 细胞（共转导），及上述方法①和方法②的相结合，将不同方法产生的双CAR 同时表达在细胞组成的CAR-T 亚群；④使用单个载体将双特异性或串联的CARs 在同一嵌合蛋白上编码2个CARs［9］。

多靶向CAR-T 中，以双靶向CAR 最常见。双靶向CAR 可以根据其识别并结合肿瘤特异性抗原的scFv与CAR的内域连接方式分为以下3种：双价串联CAR结构（bivalent“tandem”CAR），双价环状CAR结构（bivalent“loop”CAR）和Dual CAR 结构。双价串联CAR 是一种功能嵌合抗原受体，是能够介导T 细胞的双特异性激活和靶向性的新型人工分子［10］。双价环状CAR 结构是在串联双靶CAR-T 的基础上，将分别携带2 个靶点的scFv 区在细胞外形成一个环状结构［5］。Dual CAR 是由2 种不同抗原为靶点在不同单链抗体上同时表达形成的两种CAR，此种结构是通过编码内部的同一启动子的相同双顺反子载体形成的序列，从而使两个CAR 在T 细胞质膜上同时表达，因此有助于同时靶向多种肿瘤抗原，增强治疗效果［4，11］。

2 多靶向CAR-T的主要靶点

靶向多个抗原的CAR-T细胞疗法是一种有效克服抗原逃逸的策略，其中比较重要的是靶点的类型［8］。目前多靶向CAR-T在血液系统、中枢神经系统、消化系统和胸部等恶性肿瘤中有一定的研究进展。

2.1 多靶向CAR-T 在血液系统恶性肿瘤中的主要靶点

血液恶性肿瘤多靶向CAR-T的主要靶点有：CD19、CD20和CD22（三价CAR-T）［12］；CD20和人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）［13］；CD123和CD19［14］；CD19和CD70［15］；CD19和CD79b［16］；CD13 和T 细胞免疫球蛋白黏液素3（T cell immunoglobulin mucin 3，TIM3）［17］；B细胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）和钙离子信号调节亲环素配体耦合体［18］；BCMA 和CD19［19-20］；BCMA 和CD319［21］。其中抗CD19和抗BCMA多靶向CAR-T在多发性骨髓瘤中疗效较好，在临床前实验中，首次报道了新型靶点CD19和BCMA的Tan-CAR-T，此种双靶向CAR-T的细胞增殖、细胞因子释放和细胞溶解活性能力均与单靶向CAR-T相当，但在体内研究中，对小鼠异种移植模型中表达CD19和BCMA的多发性骨髓瘤生长有特异性的抑制作用，并且有助于降低单靶向CAR-T细胞治疗后的复发率［20］。在一项Ⅱ期临床试验中，将抗CD19和抗BCMA CAR-T输入复发或者难治性多发性骨髓瘤的21例患者中，有20例患者对治疗有反应，其中有17例患者在随访期间（17～602天）无复发和进展［19］。因此，双靶向CAR-T可能是治疗复发性或难治性多发性骨髓瘤的一种有前途的治疗方式。此外，关于第4代双靶向CAR-T的病例报道发现，1例患有原发性中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤的老年患者，在大剂量化疗抢救治疗失败后发生第2次复发，免疫组织化学法检测显示，组织中的CD19、CD70表达，采用抗CD19和CD70 Dual CAR-T治疗，患者在无细胞因子释放综合征、CAR-T细胞相关神经毒性或其他严重并发症的情况下生存期超过17个月，在CAR-T细胞输注321天后仍然可以检测到抗CD19和CD70 CAR-T细胞［15］。以上研究表明多靶向CAR-T细胞靶向2种及2种以上相关抗原可能是解决难治性疾病或疾病复发问题的一种有希望的策略，并且有延长患者生存期的治疗效果。

2.2 多靶向CAR-T 在中枢神经系统恶性肿瘤中的主要靶点

中枢神经系统恶性肿瘤治疗效果较好的靶点有：HER2和白介素13受体α2（interleukin-13 receptor α2，IL-13Rα2）［22］、表皮生长因子受体变体Ⅲ（epidermal growth factor receptor variant type Ⅲ，EGFRvⅢ）和表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）［23］。在临床前模型中，胶质母细胞瘤在单靶向CART细胞治疗后，由于抗原变异逃逸，导致肿瘤复发，为了减少抗原逃逸现象发生，提高T细胞的抗肿瘤活性，设计了一个抗HER2 scFv和抗IL13Rα2 scFv靶点串联组成的CAR外域（TanCAR），TanCARs通过诱导HER2-IL13Rα2异二聚体与HER2和IL13Rα2同时结合，当这2种抗原同时出现时，促进了T细胞活化。这种活化的T细胞比联合表达抗HER2-CAR和抗IL13Rα2-CAR的T细胞、联合表达非特异性CAR-T细胞或联合表达产物的T细胞更持久且不易耗尽［22］。此外，在动物模型实验中，EGFRvⅢ和EGFR构成的双特异性CAR-T细胞治疗阳性的EGFRvⅢ的胶质母细胞肿瘤小鼠模型，所有小鼠均有持久的应答反应［23］。此外，已有研究证明抗EGFR CAR-T细胞治疗肿瘤的主要不良反应是皮肤毒性［24］，但是在人体皮肤移植的小鼠模型中，双特异性CART细胞治疗后无证据表明对皮肤模型有毒性［23］。

2.3 多靶向CAR-T 在消化系统恶性肿瘤和胸部恶性肿瘤中的主要靶点

消化系统恶性肿瘤治疗效果较好的靶点是：人滋养层细胞表面抗原2（trophoblast cell surface antigen 2，Trop2）和细胞程序性死亡配体1（programmed cell deathligand 1，PD-L1）［25］、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和间皮素（mesothelin，MSLN）［26］。胸部恶性肿瘤治疗效果较好的靶点：纤维细胞活化蛋白（fibroblast activating protein，FAP）和单克隆抗体F19［27］。Trop2和PD-L1是胃癌的双特异性靶点，临床前研究中，双靶向CAR-T细胞治疗对Trop2和PD-L1阳性的胃癌细胞有特异性的杀伤能力，双特异性抗Trop2和抗PD-L1 CART细胞能够产生更多的干扰素γ和IL-2；在人胃癌异种移植模型中，双靶向CAR-T细胞经瘤内注射可明显抑制肿瘤生长，其中肿瘤生长曲线的统计分析表明，抗Trop2和抗PD-L1 CAR-T组的肿瘤体积明显小于单靶向CART对照组；因此抗Trop2和抗PD-L1双特异性CAR-T细胞的杀伤能力和抑制作用高于单靶向CAR-T细胞［25］。CEA和MSLN是胰腺癌的双特异性靶点，在异种移植瘤实验中，由CEA和MSLN构成的Dual CAR-T细胞治疗双抗原阳性的胰腺癌细胞系AsPC-1肿瘤移植小鼠，Dual CAR-T细胞可显著抑制AsPC-1肿瘤的生长，与单靶向CAR-T细胞相比，具有较高的抗肿瘤活性。Dual CART细胞可精确定位于肿瘤部位，对肿瘤细胞具有高度的杀伤作用，同时减轻了“靶上、靶外”毒性［26］。

FAP和F19是恶性胸膜间皮瘤的双特异性靶点，FAP主要表达于肿瘤相关成纤维细胞的表面以及特定的肿瘤类型，F19是一种单克隆抗体，可在临床试验中识别未降解的FAP［27-28］，但是两者联合的抗FAP-F19-ΔCD28/CD3ζ-CAR在CD8阳性的T细胞中表达，此种T细胞可以导致IFNγ特异性的释放，其中的双特异性抗原重新定向的T细胞在体外裂解抗原阳性间皮瘤细胞和炎性成纤维细胞，增强抗癌活性［27］。

3 多靶向CAR-T的主要优势

单靶向CAR-T细胞治疗后复发最常见的机制是靶抗原丢失。目前，已证明抗原的丢失可以通过抗原逃逸、谱系转换和抗原下调3种不同的机制发生。抗原逃逸机制是由恶性肿瘤通过获得性突变、选择性剪接靶点基因、内质网中保留突变的错误折叠的靶点蛋白而产生［11，29］。谱系转换是指肿瘤细胞通过表型转换至不同的谱系，这种转换过的谱系不具备原有的靶向受体，因此细胞可以通过谱系转换来完成抗原丢失的过程，最终导致抗原丢失，及肿瘤抵抗情况发生［30］。多靶向CAR-T可以避免抗原丢失的情况发生，在异种移植实验中，取来源于复发患者的标本建立异种移植模型，其中复发模型HMB28（CD19-/CD22+）是由于原发性致癌因子的一个点KRAS G12D发生突变，导致CD19由阳性转为阴性，但双靶向CAR-T能阻止HMB28的进展［5］，这表明多靶向CAR-T可有效的防止由于基因突变导致的靶点转为阴性的问题。多靶向CAR-T细胞结构的变化和提升，可促进免疫治疗的发展。因此，研究证明CAR结构中胞外区构象和单链抗体定位对双靶CAR的活性有显著的影响［8］。靶向FMS样酪氨酸激酶3（FMS-like tyrosine kinase 3，FLT3）在约30%急性髓性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）患者中发生突变，患者预后较差，以单链抗体结构为靶点的最初抗FLT3-CAR结构无法区分野生型和突变型FLT3，因此需要另一个靶点。靶向FLT3的配体可能是一种更有效的消除白血病的策略，并同时降低脱靶反应［31］。因此多靶向CAR-T可能是克服单靶向CAR-T细胞治疗后靶点突变或抗原下调的有效策略之一。

4 多靶向CAR-T联合其他疗法

多靶向CAR-T 可以联合其他治疗方式，增强杀瘤效果。如多靶向CAR-T联合药物、抗体、疫苗或者PD-L1 和程序性死亡受体-1（programmed cell death protein-1，PD-1）阻断剂来治疗癌症。1）多靶向CAR-T 联合药物治疗：双靶向FLT3 和FLT3 的配体的CAR-T 同时使用FLT3 抑制剂克林苯胺（crenolanib）联合治疗可以导致FLT3 表达上调及改善CAR-T 细胞的活性，从而减少FLT3 阴性比例［32］，提示多药物联合治疗可以作为预防抗原丢失的一种潜在策略。2）多靶向CAR-T 联合抗体治疗：其中最广为人知的结构是双特异性T 细胞接合器（CAR-T cells secreting BiTEs）［33］，BiTE 是一端靶向肿瘤抗原而另一端是靶向CD3ε 区域的双特异性可溶性抗体［34］，双特异性抗体是在一个分子中有2个不同抗原结合位点的抗体［35］。此种结构的CAR-T细胞能够将可溶性抗体传递到实体肿瘤微环境中［23］，将CAR-T与抗体结合治疗。3）多靶向CAR-T 联合疫苗治疗：最新的研究表明，安非他明疫苗联合双特异性CART，与单用双特异性CAR-T相比，可增强杀瘤效应，导致肿瘤生长明显减缓和生存期延长［36］，有利于提高抗原特异性表达，减少表面抗原丢失的现象发生，增强CAR-T 抗实体瘤活性，突破实体瘤治疗瓶颈。4）多靶向CAR-T细胞联合PD-L1或PD-1阻断剂治疗：将BCMA 和CD319 的双 靶向CAR-T 联合PD-1 阻断剂，可进一步加速体内肿瘤的初始清除率，获得治疗的持久性［21］。因此多靶向CAR-T联合其他方式治疗恶性肿瘤可能是克服癌症转移复发的有效策略之一。

5 结语

综上所述，多靶向CAR-T 在治疗恶性肿瘤方面具有广泛的适用性，能够减少肿瘤复发的问题。并且，三价CAR-T细胞也正在研发中，可用于治疗血液恶性肿瘤和多形性胶质母细胞瘤［37］。虽然多靶向CAR-T疗法相对于单靶向CAR-T具有明显的潜在优势，但这些产品在安全性、有效性和可行性方面还有一些尚未解决的问题，如细胞介导毒性、PD-L1 与肿瘤细胞结合、T细胞分化和衰竭导致治疗效果下降等问题［38-40］。随着研究的深入，未来可优化多靶向CAR-T 的设计，扩大多靶向CAR-T 的研究，多靶向CAR-T联合其他方式治疗恶性肿瘤可能是未来的发展方向。多靶向CAR-T可能成为克服抗原逃逸最为有效的方式之一，从而降低癌症复发的风险。