ROC曲线分析鉴别表型正常α珠蛋白生成障碍性贫血基因携带者血细胞参数的价值探讨*

陈启斌,胡 薇,陈培松,赵启波,周 斌

(1.昭通市第一人民医院检验科,云南昭通 657000；2.广州中医药大学顺德医院检验科,广东广州 528000；3.中山大学附属第一医院检验科,广东广州 510030)

珠蛋白生成障碍性贫血(下称地贫),是人类遗传性单基因遗传病,以广东和广西发病率最高,为了防止出生缺陷,广东省于2006年出台了《2006年广东省卫生厅地贫产前诊断技术规范》中,常规产前筛查中健康备孕的夫妇双方和孕妇血细胞分析,如平均红细胞体积(MCV)<82 fL和/或MCH<27 pg,做血红蛋白电泳筛查检测；血红蛋白电泳血红蛋白A2(HbA2)升高,怀疑β地贫,做β地贫或/和α地贫基因检测；HbA2正常和降低,排除缺铁性贫血后,检测α地贫基因,以上为地贫的正常筛查程序。实际工作中,有极少数α地贫基因携带者的血常规结果完全正常(表型正常),本研究旨在探讨表型正常的α地贫基因携带者与健康人群的血常规参数的差异,建立鉴别计算公式并确定截点值,期望降低表型正常的α地贫基因携带者漏检率。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2017年10月至2018年8月在广州市中山大学附属第一医院(下称本院)经基因检测为α地贫基因携带者62例,年龄22～55岁,男30例,女32例,中位数31岁,血常规结果在正常参考范围,红细胞计数(RBC):(4.3～5.8)×1012/L(男)；(3.8～5.1)×1012/L(女)；血红蛋白(Hb):130～175 g/L(男)；115～150 g/L(女)；MCV:82～100 fL(男/女)；平均红细胞血红蛋白含量(MCH):27～34 pg(男/女)；平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC):316～354 g/L(男/女)[1],排除β地贫(β地贫常见的17种基因突变结果为阴性)和营养性贫血(铁蛋白、叶酸、维生素B12结果正常),以及血液病、慢性疾病和恶病质患者。另收集在本院门诊检测无α、β地贫基因携带者健康体检者98例作为对照组,血常规结果在正常参考范围,年龄15～48岁,男54例,女44例,中位数33岁。

1.2方法

1.2.1血常规检测方法 希森美康XN9000血液分析流水线检测RBC、Hb、MCV、MCH、MCHC、红细胞分布宽度(RDW),仪器定期校准,室内质控良好。

1.2.2贫血三项检测 贝克曼生化免疫流水线检测铁蛋白、叶酸、维生素B12,配套试剂,室内质控良好。

1.2.3α地贫和β地贫基因检测方法 采用达安基因磁珠法DNA提取试剂,α地贫和β地贫基因检测试剂采用深圳亚能生物技术有限公司产品,gapPCR检测αα/-SEA、αα/-α3.7、αα/-α4.23种缺失,用反向斑点杂交检测 αCSα/αα、αQSα/αα、αWSα/αα 3种α地贫突变和17种β地贫基因突变,设置阴阳性对照,严格按试剂说明书操作。

1.3统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计分析,表型正常的α地贫基因携带者和健康人群的血常规参数的差异用独立样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义,并且计算各鉴别公式的灵敏度(SEN),特异度(SPE),约登指数(YI)。绘制受试者工作特征(ROC)曲线并计算曲线下面积(AUC),根据最大约登指数确定截点值(cut off)。

2 结 果

2.1α地贫基因结果 表型正常的α地贫以αα/-α3.7缺失多见且占比高,αCSα/αα点突变和αWSα/αα点突变占比高但数量较少；αα/-SEA缺失和αQSα/αα百分之百的异常表型。见表1。

2.2血常规参数比较 与健康对照组比较,表型正常的α地贫基因携带者的RBC、HB和RDW比较差异无统计意义(P>0.05),MCH、MCV和MCHC比较差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01和P<0.01)。见表2。

表1 各型α地贫中表型正常的α地中海贫血分布及占比

表2 表型正常的α地贫基因携带者与健康人群的血细胞分析参数的比较

表3 6个鉴别诊断公式效能结果比较

注：-表示无数据。

2.3红细胞参数鉴别诊断效能 在6个鉴别公式中,MCHC×MCV/10 000有高的鉴别作用,AUC达0.856,截点值在2.90%,62例中42例低于2.90%(42/62) 特异度93.50%,灵敏度73.50%；MCH×MCV/1 000 AUC达0.838,截点值在2.50%,62例中53例低于2.50%(53/62),特异度83.90%,灵敏度73.50%；MCHC×MCH/10 000 AUC达0.827,截点值在0.99%,62例中33例低于0.99%(33/62),特异度87.10%,灵敏度69.50%，见表3。按ROC曲线下面积诊断效率依次为MCHC×MCV/10 000>MCH×MCV/1 000>MCHC×MCH/10 000>MCH/MCV；MCHC/MCV、MCHC/MCH、MCV/MCH 3个鉴别诊断公式ROC曲线下面积<0.5,无鉴别诊断价值,未计算YI指数、特异度、灵敏度等指标，见图1。

图1 鉴别诊断公式ROC曲线

3 讨 论

珠蛋白生成障碍性贫血是我国一种常见的常染色体单基因遗传性血液病,是我国广东、广西[2]等南方各省发病高、影响大的遗传性疾病。每个血红蛋白由四条珠蛋白链组成,由两条α珠蛋白链和两条β珠蛋白链构成。α地贫的分子基础是α2和α1珠蛋白基因缺失或发生点突变,使α珠蛋白生成减少,体内过多β珠蛋白链形成四聚体(β4),从而引起血红蛋白含量、红细胞体积等发生改变,导致溶血性贫血[3]。引发α地贫主要是αα/-SEA、αα/-α3.7、αα/-α4.23种缺失,少量由αCSα/αα、αQSα/αα、αWSα/αα 3种点突变造成[4]；广东地区和广西地区α地贫基因型比例最高的3种也是--SEA/、-α3.7/和-α4.2/,点突变中αWSα/比αCSα/和αQSα/比例更高[5-6]；海南地区黎族人群中以-α4.2/和-α3.7/最常见,--SEA/较为少见[7]；云南地区常见基因--SEA/、-α3.7/和αCSα/[8]。

血细胞分析诊断贫血具有高效、方便、经济、高效等优点,如果血常规发现小细胞低色素性贫血,考虑缺铁性贫血和地贫,检测铁蛋白等铁代谢指标,如无缺铁证据,考虑地贫,血红蛋白电泳筛查中HbA2>3.5%是β地贫的特征性指标[4]；如HbA2<3.5%,考虑α地贫,分别进行α地贫及地贫的基因检测[4]。临床上根据基因型将α地贫分为静止型、轻型、中间型和重型,症状轻重不一,重型又称胎儿水肿综合征,引起流产或死胎的发生[9]。本研究中αα/-SEA和αQSα/αα这两种α地贫基因型携带者,表型百分之百的异常,αα/-SEA为基因的大片段缺失,αQSα/αα虽然是点突变,可能突变在关键位点,所以表型也较重。在中国南方,特别是广西地区常见的3种静止型α地贫(-α3.7/、-α4.2/和αWSα/),由于没有血液学表型的改变,血细胞分析和血红蛋白电泳不能发现阳性携带者[4]。本研究发现稍有不同,发现αCSα/基因携带者中也有表型正常的。构成比中,αα/-α3.7的例数较多,αα/-α3.7血液学表型与正常参考范围存在的差异范围较小,αα/-α3.7缺失型α地贫存在一定的漏诊率[10],和本研究一致。按照地贫筛查流程,血常规正常的静止型α地贫(-α3.7/、-α4.2/和αWSα/)漏检后,最大的危害是和αα/-SEA的配偶生育血红蛋白H(HbH)病的后代。α地贫表型的多样性与基因突变对α肽链合成的影响有关,当一个α基因发生缺失时,另一个正常的α基因往往代偿性功能增强,而一个α基因发生突变时,另一个正常的α基因功能并不受到影响,未发生代偿功能增强；因此,有些非缺失型α地贫的纯合子(如αWSα/αWSα)可以表现为HbH病[11]。有研究认为,在HbH病中,基因型相同而血红蛋白电泳结果及疾病的严重程度可存在显著差异[12-13]。

在实际工作中,常发现检测出α地贫缺失或突变,但血常规结果完全正常,会漏诊这部分表型正常的α地贫基因携带者。α地贫表型正常组和健康对照组相比,MCV、MCH、MCHC 3个指标差异有统计学意义,这是笔者考虑用这3个指标组成鉴别公式的原因。α地贫表型正常组的MCV和MCHC都比健康对照组明显降低,差异有显著的统计学意义(P<0.05),MCV和MCHC相乘的结果更放大差异,这是MCHC×MCV/10 000公式鉴别效能最高的原因；而α地贫表型正常组的MCH比健康对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05),由MCH分别和 MCHC及MCV相乘的结果组成的鉴别公式MCH×MCV/1 000和MCHC×MCH/10 000鉴别效能低于MCHC×MCV/10 000。由于α地贫表型正常组的MCV、MCH、MCHC都比健康对照组减小,相互除后的结果不能放大差异,导致MCH/MCV、MCHC/MCV、MCHC/MCH及MCV/MCH这4个公式鉴别效能低的原因。通过本文数据分析,血常规表型正常的α地贫基因携带者的MCV、MCHC和MCH,同健康者相比,差异有统计学意义,通过这些有意义的指标建立鉴别诊断公式,鉴别公式中MCHC×MCV/10 000<2.9、MCH×MCV/1 000<2.5、MCHC×MCH/10 000<0.99对表型正常的α地贫基因携带者筛选有超过0.8的曲线下面积,有一定的参考价值,并可以通过软件对鉴别公式计算并过滤。鉴别公式MCHC×MCV/10 000(cut off值2.895)、MCHC×MCH/10 000(cut off值0.985)、MCH×MCV/1 000(cut off值2.485)的特异度分别为93.5%、87.1%、83.9%,排除α地贫的效能依次降低。鉴别公式MCHC×MCV/10 000,除了有最高的特异度,AUC为0.856,也最高,是理想的鉴别公式。血细胞分析是诊断贫血的首要检测项目,具有方便、经济、高效等特点,因此在临床中常用于鉴别患者的贫血类型[14]；基因诊断因费用贵,操作复杂,在大多数医院及地贫低发地方的医院不能实现普查,因此寻找简单、有效、快捷的实验的鉴别诊断方案为临床一线,尤其是基层医院诊疗提供依据,减少漏诊率。

临床工作中,检测3种常见缺失型基因(-SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα)及3种非缺失型基因(αCSα、αQSα及αWS),就能检出约98.0% α 地贫基因[15],靳旺杰等[16]通过测序发现23例11种罕见的α -地贫突变基因,唐海深等[17]用多重PCR检测少见的4种α地贫基因：--THAI、--FIL、--MED、-(α)20.5,以上这些罕见的α 地贫都未描述血液学表型,其血液学表型是否正常,将通过更多研究来补充。