环状RNA在恶性肿瘤发生发展和诊疗中的研究进展*

宗曾艳，孔凡虹，王萌萌，熊 丹 综述,张秀明△ 审校

(1.深圳大学第三附属医院医学检验科，广东深圳 518001;2.安徽理工大学医学院，安徽淮南 232000)

环状RNA(circRNAs)是1976年使用电子显微镜在RNA病毒研究中首次被发现的[1]，此后在人类中也检测到了circRNA[2]。过去很长时间里，因为受检测技术的制约，circRNA一直被认为是RNA在剪切过程中产生的无作用的错误产物，随着生物信息和高通量测序技术的进步，研究人员发现并且鉴定了大量circRNA。与线性RNA不同，是闭合的环状结构，能抵抗核糖核酸酶(RNase)降解，更具有稳定性，可能在人体中有着特殊作用，现在的很多研究已经证实，circRNA在心血管，糖尿病，神经系统等疾病中均有表达上调或下调现象[3-5]，尤其在很多肿瘤疾病中也有异常表达，在不同的肿瘤类型和分期中发挥着抑癌基因，原癌基因或者两者共兼的作用[6]，人们对于环状 RNA 作为肿瘤诊断，治疗等的潜力也正在逐步进行挖掘。

1 circRNA的特征及产生机制

1.1circRNA的特征 基于目前的研究，circRNA已经被发现具有一些独特的特征，第一，circRNA种类繁多，含量丰富，半衰期长，对来自人类、猕猴和小鼠的多种组织的circRNA序列进行大规模研究，分别从这3个物种中发现了104 388、96 675和82 321个circRNA，在一些特殊情况下它的表达量甚至能达到其相应的线性mRNA的10倍以上[7-8]，并且还提示细胞质中的circRNA半衰期比与之对应的线性RNA平均20 h的半衰期更长，大多是在48 h以上，它们在各种组织、细胞、体液中都有丰富的表达[9]。第二，具有很好的稳定性，这是因为其独特的首尾紧闭连续环状结构，缺乏与各种细胞蛋白相互作用所必需的帽和尾结构，而不易被核酸外切酶降解，使其更加稳定[2]，利于检验人员在血浆、组织及外泌体中检测到，并因此有望成为肿瘤标志物。第三，circRNA还具有细胞，组织和发育阶段特异度，circRNA在造血细胞，血小板，红细胞及其成熟过程中差异表达，发挥着尚未得到充分认识的作用[10]。RYBAK-WOLF等[11]的研究中对29种不同类型或不同阶段的神经细胞和组织的核糖体缺失RNA进行了全面测序和分析，发现circRNA在大脑中具有高特异度表达。circRNA含量在神经组织[12]，尤其是突触等永久细胞中丰度很高，其水平受神经元活动调节[13]，而在不稳定细胞中丰度很低。在PATOP等[14]的研究中，证明了由于circRNA高的复制率使其含量被稀释，使得circRNA丰度和细胞增殖之间存在负相关关系。第四，circRNA在物种进化中显示出高度保守性。例如，常表达于人类中的一些circRNA，能在小鼠中检测到，有时甚至能在果蝇的大脑中发现[11]。斑马鱼29% circRNA序列与人类、小鼠和腔棘细胞circRNA序列具有同源性[15]。

1.2circRNA的产生机制 在真核生物中，circRNA大多是由mRNA前体反剪接而来，反剪接是指上游外显子的5′端与下游外显子的3′端交替循环，产生共价闭合环状。circRNA的来源途径有多种，大多取决于供体的转录本，可能来源于外显子[7]，内含子[16]，外显子-内含子[17]或者来自基因间的区域[18]，外显子circRNA含量最多，主要存在于真核生物细胞胞质中，内含子模式的主要存在于细胞核。现在发现的外显子circRNA主要形成过程有直接索尾连接和外显子跳跃两种。直接索尾连接是打破传统的线性RNA剪切，而由外显子反向剪切，将5′帽和3′尾端连接起来形成内源性环状闭合的RNA[19]；外显子跳跃，是指上游外显子3′端的剪接受体位点连接到下游外显子5′帽剪接供体位点，形成含有一个或多个跃迁外显子的RNA套索，然后，套索中的内含子序列被移除，从而产生成熟的外显子circRNA[20]，以第一种最为常见。

2 circRNA的调控机制

2.1circRNA作为miRNA海绵 miRNA是一类由小的非编码RNA，通过结合相应的miRNA反应元件来调节靶标mNA的翻译的群体，miRNA海绵是某些circRNA的主要功能。例如，cirs-7 是目前研究最为成熟的的circRNA，因其拥有70多个保守的微小反应原件，能与AGO蛋白协同影响miR-7在中枢神经系统中的功能[3]，Circ-TCF25作为miR-103和miR-107的海绵与膀胱癌细胞的一些恶性表型相关，能促进细胞周期蛋白依赖性激酶6 (CDK6)的表达类似的[21]，circRNA_100290可能作为一种竞争性的内源性RNA，通过吸收miR-29b家族成员来调控CDK6的表达[22]。通过微阵列分析及生物学信息和荧光素酶基因报告分析证明circRNA_0084043可能作为miR-153-3p的海绵，直接与之结合，发挥着致癌基因的作用，促进黑色素瘤的生长、迁移[23]。LI等[24]已经证实circVAPA在结直肠癌(CRC)患者组织和血浆中上调，并通过海绵miR-101在CRC中发挥致癌特性。

2.2参与基因表达的调控 一般来说，circRNA由于其在细胞内的位置和特殊结构，可以通过与RNA聚合酶协同，与作为海绵的线性RNA竞争，来调控其亲代或下游基因的表达，最终在转录、翻译阶段改变基因表达。有研究表明[25-26]，circRNA可能在基因调控中发挥关键作用。

2.2.1与RNA聚合酶结合形成转录复合体 外显子环状RNA(EIciRNA)可以与细胞核中的RNA聚合酶结合来调控其自身所对应基因的表达，例如与真核翻译起始因子3亚基J，poly (A)结合蛋白相互作用蛋白2结合，主要富集在细胞核，与U1小核核糖核酸颗粒和RNA聚合酶Ⅱ相互作用，以顺式作用的方式增强亲本基因的转录，这表明可能在转录水平发挥作用[27-28]。例如一个内含子circRNA(ciRNA)锚蛋白副本区域52(ciankrd52)，能够与聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)机制相互作用，通过富集亲本基因的转录位点，积极调控Pol Ⅱ转录活性，因此，敲除ci ankrd52可能降低亲本基因表达[29]。

2.2.2与其他非编码RNA竞争 circRNA与线性RNA竞争，反向剪接是circRNA形成的主要机制，规范的剪接mRNA前体(pre-mRNA)形成线性RNA，而经反向剪切形成circRNA，所以circRNA的合成通常以其线性等价物为代价的[30]，故两者剪接形式之间存在竞争。circRNA作为一种竞争内源性RNA(ceRNA)，还可以与miRNA竞争，影响靶RNA的稳定性或翻译，从而在转录水平上调控基因表达，进而参与肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移等生物学过程[31]。

2.3circRNA具有编码蛋白的能力 传统观点，5′帽和3′尾是很重要的原件，能起始和推动翻译，因此没有5′帽和3′尾结构的circRNA被认为没有编码蛋白的功能。但是来自盲肌位点的circRNA的翻译为circRNA具有编码蛋白的能力提供了强有力的证据[32]。在XIN等[33]和CHEN等[27]的研究中，由外显子，外显子-内含子产生的circRNA具有开放阅读框，而有翻译成多肽或蛋白质的潜力。YUN等[34]首次发现了RNA最丰富的碱基修饰，即在circRNA的A甲基的第6位加N元素(m6A)，到达高效启动蛋白翻译作用，这种单个的m6A位点就足以驱动翻译起始。

3 circRNA参与肿瘤进程

随着研究的深入，已经有越来越多证据表明，circRNA与肿瘤病毒作用关系密切，调控肿瘤的发生、发展，参与肿瘤细胞周期，增殖过程，促进肿瘤侵袭和迁移能力，在对肿瘤早期诊断和预后等阶段显示出巨大潜力。

3.1circRNA在肿瘤发生中的研究进展 circRNA在人体中表达差异，尤其在肿瘤细胞中表达类型和丰度差异更大，因此其可能与肿瘤发生，发展有关。例如，在CHEN等[35]的研究中，表明circRNA与直肠癌，乳腺癌等肿瘤疾病的发生有关。

3.1.1调节细胞周期和肿瘤细胞增殖 细胞增殖调控是一个复杂而精确的过程，由多种信号驱动，这些信号通过调节细胞周期使细胞分裂和生长。许多研究表明，circRNA在控制肿瘤增殖方面发挥重要作用。YANG等[36]采用定量蛋白质组学，发现小脑退化相关蛋白1反义RNA (CDR1as)是一种罕见的致癌circRNA，对肝癌患者细胞中CDR1as调控蛋白进行了鉴定，发现了高达330个在肝癌细胞G2期增强CDR1as表达的不同蛋白，这表明它们可能是受CDR1as调控的蛋白，因此CDR1as发挥调控蛋白作用，影响肝癌细胞的增殖周期，参与肿瘤的发生。LIANG等[37]研究结果发现circ-ABCB10在乳腺癌组织中表达明显上调，在接下来的菌落形成实验、细胞周期分析和凋亡实验中，发现与健康对照组相比，敲除circ-ABCB10基因后，G0/G1期细胞明显增多，乳腺癌细胞不能正常分化，乳腺癌细胞增殖受到抑制，促进细胞凋亡，为临床早期预防提供了新策略。通过双荧光素酶检测，有研究证明[38]circRNA_100269过表达抑制胃癌细胞增殖，与miR-630呈负相关关系，circRNA_100269和miR-630的直接相互作用构成了调控GC细胞增殖的新途径。

3.1.2促进肿瘤侵袭和迁移 有研究[39]发现circHIPK3沉默能抑制鼻咽癌细胞迁移和侵袭。在YUAN等[40]的研究中，证实circ_0026344水平与结直肠癌(CRC)的进展及淋巴结转移呈负相关关系。沉默ZKSCAN1mRNA和circZKSCAN1均可促进细胞增殖、迁移和侵袭，相反的，这两种形式的RNA的过表达在体内和体外能抑制肝癌的生长、迁移和侵袭[41]。研究表明雄激素受体(AR)在促进透明细胞肾细胞癌(ccRCC)转移中发挥重要作用，而circHIAT1具有抑制AR增强ccRCC细胞迁移和侵袭作用[42]。LI等[43]发现，胃癌组织中hsa_circ_0000096表达明显低于癌旁非肿瘤组织，进一步分析表明，hsa_circ_0000096通过抑制细胞周期蛋白 D1、周期蛋白依赖激酶6(CDK6)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9的表达，抑制GC细胞转移。PRMT5 circRNA通过结合海绵miR-30c诱导上皮-间质转化，促进膀胱尿路上皮癌的迁移[44]。而ZHU等[45]的研究，发现hsa_circ_0013958在肺癌患者组织、细胞和血浆中都证实了表达上调，并且表达水平与TNM分期和淋巴转移有关。Hsa_circ_0072995调控乳腺癌细胞的侵袭和迁移[46]。

3.1.3circRNA在病毒相关肿瘤中的作用 肿瘤病毒包括人乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒等，可引起多种肿瘤。病毒与宿主因子之间的作用机制还不是很了解，有研究表明circRNA与病毒相互作用，诱导肿瘤发生或作为病毒性circRNA和抗病毒性circRNA参与未来肿瘤的治疗。在对卡波氏肉瘤(KSHV)的研究[47]中，在KSHV感染细胞和KSHV阳性患者检测到了hsa_circ_0001400，它可以通过抑制关键的病毒基因而发挥抗病毒分子的作用，这是新的宿主病毒与circRNA相互作用机制，加深了笔者对这种肿瘤病毒的理解，推测在其他病毒感染导致的肿瘤中可能也有这种情况，因此这种抗病毒circRNA或病毒circRNA可能作为未来治疗病毒所致肿瘤的靶点。经过UNGERLEIDER等[48]的一系列实验，确定了广泛的病毒circRNA可能在EB病毒感染的伯基特瘤和胃癌以及那些在病毒裂解复制的潜伏阶段起着独特的作用，该研究进一步扩展了病毒转录组的功能，并为发现EBV如何促进感染、诱导肿瘤发生的新机制奠定了基础。在TOPTAN等[49]的研究中，发现EB病毒(EBV)和卡波氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)能导致2%的人类癌症，包括EBV阳性的Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌等，EBV和KSHV都能编码circRNA，是一类新的病毒转录产物，在病毒相关肿瘤中表达，可能有助于病毒的致癌，为在肿瘤病毒发病机制中发挥作用的新形式的病毒基因表达研究提供了一个方向。ZHANG等[50]发现circRNA (circ-Vav3)在 宿主或宿主细胞感染禽白血病病毒J亚群(ALV-J)后表达上调，circ-Vav3通过增强gga-miR-375靶基因YAP1表达，进一步研究证实了circ-Vav3/gga-miR-375/YAP1轴可以影响上皮间质转化(EMT)，而促进禽类肝脏肿瘤形成。高危人乳头瘤病毒E7癌基因的表达是维持恶性表型和转化的必要条件，ZHENG等[51]首次全面描述了HPV-16 E7调控的circRNA在宫颈癌细胞中的表达谱，直接证明了病毒致癌基因有可能影响多个circRNA的丰度，促进HPV阳性癌细胞的生长。这些研究增加了笔者对circRNA与病毒相关的肿瘤机制的认识。

3.2circRNA在肿瘤诊断中的研究进展 临床上对恶性肿瘤的早期诊断对于患者的治疗，预后十分重要。肿瘤诊断领域一直是全球科学家研究的热点，新的肿瘤诊断方法不断涌现，而非侵入性生物标志物或液体活组织检查有可能很大程度上促进肿瘤症患者的生存率，因为可以重复采样以便实时，动态监测疾病进展，这两者都是个性化医疗的基石。现有的诊断肿瘤的技术包括核磁共振成像、CT、病理组织切片等费用昂贵，并且需要注射造影剂，对人体有一定创伤性。而circRNA的稳定性，特异度，含量丰富，在肿瘤组织与正常组织中表达异常等特征，是未来作为恶性肿瘤早期诊断的理想的标志物[52]。现有的研究表明，hsa_circ_0000190可能是一种新的无创胃癌诊断生物标志物，其灵敏度和特异度均优于常用的CEA、CA19-9等生物标志物[53]。hsa_circRNA_100395等关键的circRNA有望作为 乳头状甲状腺癌的诊断生物标志物[54]。ZHU等[45]的研究结果表明，hsa_circ_0013958可以作为一种潜在的无创生物标志物，用于肺腺癌的早期诊断和筛选。

3.3circRNA在肿瘤预后中的研究进展 有研究发现，circRNA在判断肿瘤预后情况和预测复发中起着重要作用。在YUAN等[40]的研究中，通过异种移植实验，表明circ_0026344过表达能促进细胞凋亡，提示circ_0026344是一种抑制基因，低表达预测CRC患者预后不良，可作为未来临床判断CRC预后情况指标。在另外一个研究中，运用逆转录聚合酶链反应(RT-PC)对102个肝癌患者(HCC)的样本进行了微阵列分析发现，circZKSCAN1表达明显低于相邻非肿瘤组织中，差异有统计学意义(P<0.05)，并且将会以此建立该肿瘤的相关预后标志物[41]。在一个类似的肝癌研究中[55]，circMTO1被证明作为miR-9致癌的海绵能促进p21的表达，抑制HCC的进展，提示circMTO1是HCC治疗有利的结合位点，而HCC组织中circMTO1的表达降低可能是患者生存期较差的预后指标。SHUAI等[56]的研究成果表明，circRNA_0000285可能是鼻咽癌患者预后的一个独立预后因素，提示circRNA_0000285可能是鼻咽癌的一种新的生物标志物并与鼻咽癌的放射敏感性有很大关系。类似的。有研究[39]表明circHIPK3表达水平也可以作为鼻咽癌患者预后的一个指标。circPRMT5作为一种新型的致癌circRNA，也是膀胱尿路上皮癌的预后标志物[44]。circ-FBXW7I编码功能蛋白FBXW7-185aa，可能对胶质瘤的预后有潜在的影响[57]。

4 该领域存在的问题

该领域的研究仍存在一些不足。首先，对circRNA的识别、量化、验证以及过表达和沉默方法都依赖于特定的反剪接，由于单个circRNA的序列与其同源的线性RNA亚型完全重叠，因此分析circRNA的功能意义一直是一个挑战[58]。第二，关于其转录后调控机制仍有待探索。例如，还不了解它们最终如何被降解，以及它们的结构如何与相对应线性RNA产生功能差异的。第三，专门用于确定circRNA的生物信息学预测仍处于初级阶段，circRNA的命名大多数是根据其功能命名的，而没有明确，正式的规则[35]，命名标准化将有助于生物信息学和circRNA起源和功能的实验研究。虽然现在已经建立了几个数据库，但基于生物信息学的方法也会出现误差，因此应谨慎处理对circRNA的注释，并结合多种算法，及时更新数据库，便于更全面准确地利用这些数据库。第四，除了经典的反剪接和外显子跳跃形成circRNA外，还有其他剪接或转录后修饰的模式可能存在，例如通过逆转录酶的模板切换、串联复制等[58]。此外，现有的检测方法还难以对circRNA和其他类型的微小RNA进行准确的区分。虽然Northern blot方法因其直观准确、不容易出现模板切换等特点，被提议为circRNA研究的金标准[27]，但更为准确的研究技术还有待于进一步开发。

5 总 结

目前，对circRNA特征及功能方面的研究已比较成熟。circRNA在肿瘤发生发展、侵袭转移方面的调控机制研究也取得了很大进展。但circRNA在临床应用方面还存在一些不足。如circRNA应用于疾病分子标志物还缺乏大批量临床验证，还停留于基础研究阶段，难以做到向临床转化。根据以往研究，circRNA主要功能之一是充当miRNA海绵。因此，通过研究内源性环状海绵结构，结合位点等，设计和开发有效的人工海绵，或者根据其特殊的反剪接形成机制研究出能增强有利circRNA表达和沉默有弊circRNA的新药物，在不产生副作用的情况下调控人体中circRNA丰度，最大限度的将circRNA运用于临床。