干细胞移植治疗血栓闭塞性脉管炎的疗效判定

刘 浩 方 圆 潘天岳 方 刚 蒋小浪 魏 征 顾史洋陈 斌 蒋俊豪 石 赟 郭大乔 徐 欣 杨 珏 史振宇竺 挺 刘 彭 虞 奋 董智慧 符伟国

1 复旦大学附属中山医院血管外科，上海 200032 2 复旦大学附属中山医院血液科，上海 200032

血栓闭塞性脉管炎（thromboangiitis obliterans，TAO），也称为Buerger 病，是一种节段性非硬化性炎性疾病，TAO 主要累及四肢的中小动脉及静脉，导致重度肢体缺血（critical limb ischemia，CLI）甚至坏死[1]。TAO 好发于年轻人，尤其是年龄小于45 岁的男性，也可在女性中发病。吸烟在TAO 的起病及进展中均起到重要作用，是其最重要的危险因素[1]。在一项回顾性研究中，110 名经过旁路手术等传统方法治疗的TAO 患者的截肢率高达43%[2]。由此可见，TAO 所导致的肢体和劳动力丧失对于患者及其家庭及社会造成的打击和负担非常沉重。2002 年，Tateishi 等[3]首先报导了移植骨髓单个核细胞治疗CLI；2009 年，Kawamoto 等[4]首次报导了移植纯化CD34+细胞治疗TAO 导致的CLI，并取得了满意的结果。2009 年4 月，复旦大学附属中山医院血管外科开始了关于CD34+细胞移植治疗CLI 的临床探索，并取得了理想的初期结果[5]。

迄今为止，在中心接受自体干细胞移植的患者已超过160 余名。研究报道自体纯化CD34+细胞移植（autotransplantation of purified CD34+cells，ATPCC） 治疗血管炎导致的重度肢体缺血（angiitis-induced critical limb ischemia，AICLI）的近、中、远期疗效[6-7]，表明ATPCC 治疗AICLI 的可行性，安全性及有效性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2014 年4 月至2016 年12 月接受ATPCC 的23 名TAO 患者术前及术后随访情况。纳入和排除标准[5-6]，纳入标准：（1）18～80 岁男性或女性；（2）中重度肢体缺血（卢瑟福4～5 分）；（3）病程＞4 周；（4）旁路手术或腔内手术不可行；（5）若存在溃疡，经4 周的规范治疗后未痊愈。排除标准：（1）3 月内发生过心血管事件、肺栓塞及重度肝肾功能异常等健康事件；（2）增殖性视网膜病变；（3）预期寿命＜1 年；（4）禁忌使用重组人粒细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF）。在随访不同时期，比较不同指标变化规律及特点，总结并归纳出在TAO 治疗的不同时期采用何种指标进行疗效判定。

1.2 方法

粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）动员5 日，期间每日皮下注射低分子肝素1 支（4100 IU）并检查外周血细胞计数。第5 日晨G-CSF皮下注射后行血常规及CD34+流式细胞（FACS）检测，静脉注射葡萄糖酸钙及地塞米松5 mg。采集、分选后，苔盼蓝染色检测纯化终产物细胞活力，FACS 检测CD34+细胞纯度。全麻下分点肌肉注射纯化产物，患者术后长期服用阿司匹林和和西洛他唑[7-9]。

1.3 观察指标

所有患者术后1、2、3、6 及12 月定期随访，之后每12 月随访一次（图1）。术后所观察的指标包括疗效性指标和安全性指标。主要疗效性指标包括：总无截肢生存率（total amputation free survival rate，TAFS）及主要无截肢生存率（major amputation free survival rate，MAFS）；次要疗效性指标包括：踝肱指数（ankle-brachial index，ABI）、趾肱指数（toe-brachial index，TBI）、经皮氧分压（transcutaneous partial oxygen pressure，TcPO2）、 无痛步行时间（pain-free walking time, PFWT）（2.5 km/h，坡度10°）、Wong-Baker 疼痛评分（Wong-Baker FACES pain rating scale score，WBFPS）、复发及再发、溃疡愈合率、生活质量评分（quality of life, QOL）及劳动力恢复率。其中QOL 是通过使用SF-36 v2 量表八个模块（生理机能、生理职能、躯体疼痛、一般健康状况、精力、社会功能、情感职能和精神健康）中生理机能和一般健康状况来定期评估患者的术前及术后生活质量[10]。安全性指标包括观察患者自动员开始至移植后2 周内所发生的所有不良事件及全因病死率、病理性血管新生及移植后白细胞持续性增高。复发定义为移植侧肢体再次发生CLI，再发定义为非移植侧肢体发生CLI。

图1 患者随访期间流程图

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，组内比较采用配对t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05 时为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料

23 例TAO 患者，均为男性，年龄24～54 岁，平均（41.1±10.1）岁。20 名患者具有主动吸烟史。术前卢瑟福分级，1 名患者为4 级，22 名为5 级，所有患者术前均因疼痛或坏疽丧失劳动能力。截止到2019 年10 月，23 例患者中1 例失访，1 例患者于术后27 个月因心脏疾病死亡，21 例患者规律随访34～66 月，平均随访时间（46.7 ± 10.2）月。共治疗23 条肢体，其中22 条下肢，1条上肢，平均移植CD34+细胞量（6.5 ± 6.1）×105/kg，苔盼蓝染色测细胞活力97.65%～99.50%，平均活力（98.30±0.67）%，所有患者都取得了技术的成功。

2.2 临床疗效

2 例患者于移植术中行Ⅰ期清创，5 例患者于移植后6 月内行Ⅱ期清创截趾，无患者于移植后行踝上截肢。

2.2.1 WBFPS 比较

WBFPS 评分，移植后24 个月（1.17±2.29）分和移植后1 个月（7.24 ± 2.91）分均低于移植前（8.20±1.83）分，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

2.2.2 血液灌注指标比较

移 植 后12 个 月ABI（0.586 ± 0.247）高 于 移 植 前（0.472±0.254），差 异 有 统 计 学 意 义（P＜0.05，图3A）。移植前4 例患者因足趾溃疡或坏疽不能行TBI 检查，19 例患者移植前TBI 为（0.117±0.155），移植后各时间点TBI 均高于移植前，差异有统计学意义（P＜0.05，图3B）。移植后2 和3 个月的TcPO2与移植前（20.60±13.70）比较，差异有统计学意义（P＜0.05，图3C）。

2.2.3 功能指标比较

23 例患者术前卢瑟福分级均≥4 级，所有患者移植前均存在静息痛。静息痛平均缓解时间为（5.43±8.25）周。移植前23 名患者的PFWT 为（308.8±430.3）s（10例患者因足底溃疡或疼痛等原因无法行走），移植后1、6、12、24 及36 个月的PFWT 分别为（160.3±75.4）s、（593.3±449.4）s、（870.6±429.8）s、（922.2±521.9）s及（1010.0±417.4）s，与移植前比较，差异有统计学意义（P＜0.05，图3D）。

2.2.4 溃疡愈合率、总无截肢生存率和主要无截肢生存率比较

移植前95.65%（22/23）患者存在溃疡，移植后6、12 月、24 和36 个月的溃疡愈合分别为54.55%（12/22）、72.73%（16/22）、95.45%（21/22）和95.45%（21/22），与移植前比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

移植后6 个月，6 例患者因感染等原因行截趾术；移 植 后6、12、24 及36 个 月 的MAFS 分 别 为95.65%（22/23）、95.65%（22/23）、95.65%（22/23）及91.30%（21/23）；TAFS 分 别 为73.91%（17/23）、73.91%（17/23）、73.91%（17/23） 及69.57%（16/23）。（ 图4A-B）

2.3 复发/再发

图2 随访期间TAO 患者WBFPS 评分

图3 血液灌注恢复和功能改善指标变化

图4 随访期间TAO 患者的MAFS 及TAFS

3 例患者4 条下肢在移植后发生复发/再发，第1 例患者移植后8 个月再发，18 月复发，双下肢均表现为间跛；第2 和3 例患者分别于移植后21 个月及35 个月再发，分别表现为静息痛及间跛。第1 和2 例患者移植后因静息痛缓解再次吸烟，第3 例患者移植后因工作原因长期吸入二手烟。

3 例患者复发/再发后行药物治疗并强调戒烟或避免接触二手烟，后第1 和2 例患者症状均缓解，无需再次行干细胞移植干预；第3 例患者因间跛症状持续不改善，发展至静息痛甚至坏疽，于右下肢移植45 个月后再次行左下肢干细胞移植，患者左下肢术移植8 个月就诊于整形科行左足截趾，现左下肢术后9 个月，静息痛及间跛症状消失（图5）。

移植后1～3 个月，23 例患者的卢瑟福分级与移植前比较，差异无统计学意义；移植后6～36 个月与移植前比较，差异有统计学意义（P＜0.01）（图6）。

卢瑟福分级0～3 级患者为非CLI，移植前，非CLI状态所占比例为0%（0/23），移植后6 个月为47.83%（11/23），24 个月时达到顶峰78.26%（18/23）（图6）。

图5 1 例再发患者的足部随访照片

图6 随访期间TAO 患者卢瑟福分级分布

2.4 生活质量比较

23 例患者术前均因疼痛或溃疡丧失劳动能力，移植后除去失访1 例及死亡1 例，余21 例患者全部恢复劳动能力，重返社会岗位。移植后12 个月及36 个月的QOL 的生理机能和一般健康状况均优于移植前，差异有统计学意义（P＜0.05）。（图7A-H）

2.5 安全性指标

23 例患者，自动员开始至移植后2 周内均未出现任何不良反应及死亡事件；细胞移植及随访期间也未发现任何诸如眼底血管新生等病理性血管新生事件；随访期间的化验结果证实了无移植后白细胞持续性增高。

3 讨论

TAO 作为一项好发于中青年男性的炎性疾病，其病理特征诸如中小血管累及、炎性浸润及血管弹力层完整等[6]决定了其经传统手术及腔内治疗疗效不佳，旁路术后1、5 和10 年的Ⅰ期通畅率分别41%、32%和30%，Ⅱ期通畅率54%、47%和39%[11-12]；经长期治疗后，TAO截肢风险在确诊5 年后为25%，10 年后为38%，20 年后为46%[13-14]；42 岁前劳动力丧失率高达34.8%[11-12]。可见，TAO 对家庭及社会均带来了沉重的负担，因此，对于TAO找到适合的治疗方法及对治疗方式的疗效进行及时、有效的判定就显得至关重要。

TAO 患者就诊时最常见的主诉为疼痛，因此，疼痛相关指标如WBFPS 及PFWT 应是早期疗效所关注的重点。本研究中，23 例患者疼痛缓解时间集中在2 周左右，在移植后第一次随访（移植1 个月）时WBFPS 较移植前，差异有统计学意义，在移植6 个月进入“平台期”，之后保持在一个相对稳定的水平。PFWT 是指患者在2.5 km/h，坡度为10°的运动平板上所能行走的最长时间（21 min为检查所设定的最长时间），相对于WBFPS，PFWT 是一种功能性测试，一定程度上可以反映患者行走功能的恢复情况[15]。移植前，10 例患者因疼痛或溃疡等原因无法进行测试，记为0 s，移植1 个月，10 例患者中已有6 例可以进行测试，自移植后，PFWT 与移植前比较，差异有统计学意义。移植12 个月PFWT 进入“平台期”，移植36 个月，已有15 例患者的PFWT 达到21 min。因此，WBFPS 及PWFT 可以作为TAO 治疗疗效的早期（12 月内）判定指标。

图7 移植前、移植后12 个月及36 个月的QOL 评分

相对于以上两项指标，本研究中卢瑟福分级在移植6个月后与移植前比较，差异有统计学意义，还有文献报道卢瑟福分级在12 个月才出现统计学差异[5]，后持续改善至移植24 个月并保持稳定。因此，卢瑟福分级及相应的非CLI 比例作为评价患者肢体缺血等级的指标，应当用在对TAO 中远期疗效评估当中。

在反映血流灌注的ABI、TBI、TcPO2 等指标方面，ABI 仅在移植6、12 个月与移植前比较，差异有统计学意义，TcPO2在随访的任何时期与移植前比较，差异无统计学意义，而TBI 自移植2 个月起就与移植前比较，差异有统计学意义。提示TAO 治疗后TBI 的改变与患者症状的缓解可能要比ABI 和TcPO2更加符合，TBI 这一指标的引入避免了远端病变情况下ABI 判定的不足。

TAO 患者的5 年生存率为97%，要远高于下肢动脉粥样硬化患者[16]，而且平均年龄较轻[17]，42 岁前劳动力丧失率高达34.2%[11]。因此其对于疗效的要求通常停留在挽救肢体，也期待着改善其活动能力，重返劳动岗位。对患者移植前后的QOL 采用SF-36 v2 量表进行评估，移植36 个月，除去失访1 例及死亡1 例，69.57%的患者能够重新开始工作，26.1%的患者甚至能够从事相对重体力劳动，这不仅对于TAO 患者来说意义尤为重大，对于社会也有积极的意义。

除了治疗方法的有效性外，持久性也是应重点关注的一方面。移植36 个月的MAFS 及TAFS 分别为91.30%和69.57%，与Kondo 等[16]报道相似，表明ATPCC 在保肢方面取得了理想的中远期结果。复发及再发方面，3 例患者的3 条下肢再发，1 条肢体再发，复发/再发时间多集中在1～2 年期间。吸烟作为TAO 目前已知的最重要的危险因素[1]，复发/再发的3 例患者中2 例术后未能完全戒烟，1 例术后因工作原因长期接触二手烟，因此强调戒烟/避免二手烟应作为患者术后不应忽视的注意事项。移植前22 例患者有不愈溃疡，6 月溃疡愈合率为54.55%，至36 月溃疡愈合率逐步上升至95.45%（1 人失访，按溃疡不愈处理）。

ATPCC 在治疗TAO 方面表现出了安全有效的近、中、远期疗效。通过这一研究，提示在TAO 治疗后的近期及中远期应着重观察不同的指标，WBFPS 及PFWT 作为早期出现改变后进入平台期的指标，应作为早期观察的重；卢瑟福分级作为较晚出现改变的指标，应当作为TAO 治疗后中远期观察的指标。针对疗效持久性方面，复发/再发率可以作为较客观的指标。另外，针对患者的特点，QOL 及劳动力复发率无论是对于患者本人、家庭甚至是社会都具有重要意义。本研究病例数尚少，有待大规模前瞻性对照临床研究提供更为有力证据。