抗氧化剂防治老年性聋的研究进展

欧阳朝明 董杨

(上海中医药大学 1教学实验中心，上海 201203;2基础医学院)

衰老是一种普遍的生理现象，以生物体时间依赖的功能衰退为特征〔1〕。此过程常伴随着与年龄相关的听力损失，也称老年性聋。老年性聋是老年人中最常见的感觉障碍，调查显示，在65岁以上的人群中，老年性聋的发病率为25%～40%，大于75岁的老年人中，其发病率为48%～66%，而85岁以上的老年人发病率则超过80%〔2〕。老年性聋还会导致社交孤独、抑郁和认知能力障碍等疾病。据2016年的全球疾病负担(GBD)报告显示，听力丧失已成为致残年数(YLDs)的第三大原因，也是全球健康的一个重要问题，特别是在老年人口中〔3〕。

1 老年性聋的氧化应激发病机制

到目前为止，老年性聋的发病机制尚不十分清楚。氧化应激造成的损伤是目前比较公认的老年性聋发病机制之一。生理状态下，活性氧(ROS)作为细胞信号转导和细胞周期调节的氧化还原反应信使发挥功能，可以被内源性的抗氧化机制代谢和清除。氧化应激是指ROS生成和生物体抗氧化损伤能力的失衡。耳蜗中的ROS主要来源于线粒体，线粒体DNA(mtDNA)对于ROS造成的损伤尤为敏感，一个原因是mtDNA位置与ROS产生的位置相近，另一个原因是，与核DNA相比，mtDNA损伤修复的能力更为有限〔4〕。Falah等〔5〕对老年性聋患者的mtDNA控制区4种核苷酸变异频率进行研究，共有58例老年性聋患者和220例对照者参加了这项研究，采用聚合酶链反应和Sanger测序法研究mtDNA控制区的遗传变异，研究结果显示，老年性聋患者mtDNA控制区的4种核苷酸变异频率与对照组比较差异有统计学意义，进一步支持了线粒体在老年性聋发展过程中细胞内机制中具有重要作用，这些变异有可能成为老年性聋发生高风险的诊断标记。Du等〔6〕研究发现，在注射D-半乳糖8 w的拟老化SD大鼠模型中，耳蜗mtDNA普遍缺失和线粒体超微结构损伤增加，耳蜗中NADPH氧化酶(NOX)3、8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OHdG)、NADP氧化酶亚单位(P22phox)、活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-Caspase)3表达及脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)阳性细胞数均高于对照组，表明一氧化氮合酶NOX3介导的氧化应激促进了mtDNA突变的聚集，激活Caspase3依赖性细胞凋亡信号通路促进耳蜗老化过程细胞死亡。除了外周改变外，有研究者对听觉中枢听皮层进行研究发现，伴随年龄增长的核因子E2相关因子(Nrf2)信号通路活性降低及相关的mtDNA损伤，是老年性聋听皮层老化的主要机制之一〔7〕。正常情况下，线粒体产生的ROS易为内源性抗氧化剂代谢清除，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)或其他相关的酶，以维持内耳的动态平衡，而衰老过程打破了这种稳态。近期，有研究报道从细胞水平和整体水平研究ROS介导的DNA损伤应答是否推动了耳蜗毛细胞的老化，结果显示，过氧化氢(H2O2)暴露可以使耳蜗毛细胞磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)和P53结合蛋白(53BP1)的表达增加，启动 DNA损伤应答，而合成的SOD/CAT模拟物含锰氧化应激抑制物(EUK-207)在体外可减轻H2O2诱导的耳蜗细胞DNA损伤和衰老表型，在体内可减缓快速老化小鼠模型(SAMP8)小鼠年龄相关的听力损失和耳蜗毛细胞退化，综上得出结论，ROS诱导的DNA损伤应答推动了耳蜗毛细胞的衰老，可以加快老年性聋的发生发展〔8〕。

2 抗氧化剂与老年性聋

在老年性聋中，毛细胞或螺旋神经节神经元一旦损失，会导致听阈升高，不能再恢复到正常水平，因为这两类细胞在哺乳动物中都是不可再生的。因此，预防和延缓是老年性聋的重要干预手段。抗氧化剂是目前防治老年性聋研究较多的一类药物，主要通过降低氧化应激造成的损伤来延缓老年性聋的发生〔9，10〕。抗氧化剂分为直接抗氧化剂和间接抗氧化剂，直接抗氧化剂比如辅酶(Co)Q10和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，可以直接跟ROS反应降低氧化应激；间接抗氧化剂，比如酚类化合物和营养物质，可以激活细胞氧化还原酶〔11〕。

2.1直接抗氧化剂 NAC具有很强的清除ROS的能力，还能上调还原型谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶(GXH-Px)，并通过防止脂质过氧化而抑制ROS的产生。在Ding等〔12〕的研究中，采用Ggt1基因核苷酸缺失突变(Ggt1dwg/dwg)转基因小鼠，该小鼠体现为γ谷酰基转移酶1基因功能突变，而这个基因主要编码一种对于GSH合成有重要作用的抗氧化酶。结果显示，用Ggt1dwg/dwg转基因小鼠体现了年龄相关的听力损失和病理改变，是老年性聋的理想模型，NAC能减轻Ggt1dwg/dwg转基因小鼠的年龄相关性听力损失和内毛细胞损失，认为NAC具有延缓老年性聋的作用。还有研究在SAMP8老化小鼠上观察到，NAC可以延缓伴随老化的听力损失，对耳蜗毛细胞有保护作用〔13〕。Tan等〔14〕采用线粒体蛋白抑癌基因(FUS1)的基因敲除(FUS1 KO)小鼠，作为代谢型老年性聋小鼠模型，研究结果发现，在出现严重听力丧失之前，3月龄FUS1 KO小鼠耳蜗的抗氧化、营养物质和能量感知通路就已经发生病理改变，4～5月龄的FUS1 KO小鼠即出现耳蜗内电位(EP)的下降，认为可能是由于小鼠耳蜗血管纹中严重的线粒体和血管病变所致。短期给予抗氧化剂NAC治疗可以纠正这些病理分子变化，而长期给予NAC可以恢复EP，改善听性脑干反应(ABR)听阈值，修复线粒体结构，进而延缓老年性聋小鼠的听力损失。

维生素C是一种重要的亲水性抗氧化剂和脂质过氧化抑制剂，与老年性聋的发生有密切关系。Kang等〔15〕基于韩国国民健康与营养调查的数据，通过对1 910位参与者的数据进行单变量和多元线性回归分析得出结论，饮食中摄入维生素C与老年人听力改善显著相关，而只有不到一半的老年人获取了足量的维生素，随着年龄增加，维生素摄入会减少，因此认为补充合适的维生素有利于抑制老年人的听力下降。老年性聋是多种原因造成的复杂疾病，单一干预手段可能不能达到良好的治疗效果，两种或以上治疗手段联合，比如抗氧化剂与耳蜗血管扩张剂联合使用有可能达到更好的治疗效果〔16〕。Alvarado等〔17〕给3月龄Wistar大鼠服用自由基清除剂维生素A、C、E和耳蜗血管扩张药镁离子(Mg2+)的联合制剂，在6～8月龄和12～14月龄进行听功能检测，结果显示，给药组听阈值明显低于对照组，表明该联合制剂可以延缓年龄相关的听功能损伤，对老年性聋有辅助的治疗作用。CoQ10是一种存在于自然界的脂溶性醌类化合物，其结构与维生素K、维生素E相似，是作用较强的脂溶性抗氧化剂。有临床试验观察到，口服水溶性CoQ10可以改善老年性聋患者的听力损失〔18〕。Someya等〔19〕的研究发现，C57BL/6J小鼠口服CoQ10和α-硫辛酸均可以抑制耳蜗Bak基因表达，降低耳蜗细胞损伤，延缓老年性聋。α-硫辛酸是一种兼具水溶性和脂溶性的抗氧化剂，是一种类似维生素的物质。Ahn等〔20〕研究发现，α-硫辛酸可以抑制近交系(DBA)小鼠早发性的听力损失。

动物实验研究发现，口服六种抗氧化剂L-半胱氨酸-谷胱甘肽(L-CySSG)、核糖半胱氨酸、NW-硝基-L-精氨酸甲酯(LNAME)、维生素B12、叶酸和维生素C的混合溶液，可以明显改善C57BL/6小鼠年龄相关的听力损失。其中，L-CySSG是L-半胱氨酸和GSH的混合物，抗ROS非常有效；而核糖半胱氨酸是半胱氨酸前体药物，半胱氨酸又是GSH生物合成中的关键成分；LNAME是NOS抑制剂，因此它能减慢或阻止耳蜗内一氧化氮(NO)的产生及其随后的损害作用；维生素B12和叶酸在DNA合成和修复中至关重要〔21〕。

2.2间接抗氧化剂 Sanz-Fernandez等〔22〕选用了6种多酚类化合物单宁酸、白藜芦醇、槲皮素，芸香苷，没食子酸和桑色素混合在一起，观察其对大鼠年龄相关听力损失的作用，发现该多酚类混合物可以明显改善大鼠多频稳态听觉诱发反应(ASSR)和ABR的听阈值，有延缓老年性聋的作用。Sánchez-Rodríguez等〔23〕的研究也发现，该多酚混合物可以减低老年大鼠升高的ROS水平，改善老年大鼠的SOD与GSH-Px的活性，显著改善ASSR阈值。该多酚混合物还可以降低老年大鼠耳蜗DNA氧化损伤标志物8-OHdG水平和三磷酸腺苷(ATP)水平，下调凋亡相关蛋白Caspase-3/9的表达，认为多酚可以降低老年大鼠耳蜗的氧化应激水平，抑制细胞凋亡，从而达到延缓老年性聋的作用〔24〕。

3 具有抗氧化作用的中药与老年性聋

中药中有许多具有抗氧化作用的成分，是巨大的天然抗氧化剂宝库。Tanigawa等〔25〕研究发现，大豆中的大豆β-伴球蛋白(β-Conglycinin)可以提高耳蜗血流，提高血管纹中的内源一氧化氮合酶的表达，缓解氧化损伤，降低血管纹中边缘细胞的脂褐素颗粒和微血管周细胞空泡变性；β-伴球蛋白还能减轻耳蜗螺旋神经节细胞损失，降低脂褐素颗粒、核内侵、髓鞘空泡化的频率。综上，认为β-伴球蛋白主要通过维持耳蜗血管血流和抑制氧化应激来改善老年性聋。银杏叶提取物EGb761作为一种ROS清除剂，它能防止脂质过氧化、提高GSH含量及GSH还原酶的活性。Nevado等〔26〕的研究显示，EGb761可以改善12月龄SD大鼠的ASSR，下调促凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-7的表达。Liu等〔27〕研究发现，石榴皮提取物能通过调节蛋白磷酸酶1核靶向亚单位/蛋白磷酸酶1(PNUTS/PP1)信号通路降低氧化应激对耳蜗的损伤，从而减缓了D-半乳糖诱导的老年性听力损失，具有防治老年性聋的作用。白藜芦醇是一种多酚二苯乙烯类物质，存在于葡萄、桑树、花生、朝鲜槐等多种植物中，在中药土茯苓、虎杖、何首乌、三七、厚朴中也有一定含量，有研究表明，白藜芦醇能显著地抑制miR-34a过表达及H2O2氧化损伤导致的耳蜗毛细胞株HEI-OC1死亡，用之喂养C57BL/6J小鼠两个月后，显著降低了小鼠的听阈值和耳蜗毛细胞的丢失〔28〕。Du等〔29〕研究发现，罗布麻宁可以抑制D-半乳糖导致衰老模型大鼠蜗腹侧核的NOX活性、H2O2水平、mtDNA共同缺失和8-OHdG表达，并提高总SOD(T-SOD)和GSH-Px的活性；罗布麻宁还可以减轻D-半乳糖的衰老模型大鼠蜗腹侧核线粒体超微结构损伤，促进ATP产生，提高线粒体膜电位水平，抑制细胞色素C从线粒体进入细胞质及Caspase 3依赖的细胞凋亡。

综上所述，由于毛细胞不具有再生能力，预防和延缓老年性聋是主要策略。研究者在老年性聋的动物模型上观察到许多抗氧化剂体现了延缓年龄相关性听力损失的作用，是潜在的抗老年性聋药物，但大多缺乏进一步的药学相关研究，临床研究也较少，离临床应用尚有很长的距离。由于氧化应激无疑是老年性聋等衰老相关疾病的重要发病机制之一，因此抗氧化剂仍然是目前防治老年性聋一类潜在药物，值得深入探讨和研究。更值得注意的是，抗氧化剂除了常见的化合物外，中药也是一个巨大的资源宝库，其种类繁多，尚有许多我们不清楚的抗氧化成分。因此，应借助中药基础理论的指导，以中药现代化研究手段的进步为依托，努力探索发掘提取其中的有效成分。另外，还可对现有抗氧化剂进行结构修饰等提高药效，也是研究抗氧化剂防治老年性聋的重要思路。