耳蜗毛细胞再生机制研究最新进展

韩贺舟 董耀东 魏薇 马秀岚

中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉头颈外科

毛细胞是构成听觉感受器的重要组成部分，研究表明，老化、噪声及耳毒性药物均可造成毛细胞损伤，进而导致感音神经性听力损伤[1]。目前，国内外最新研究结果显示，耳蜗毛细胞在鱼和两栖类动物中损伤后可以再生，但在哺乳动物中损伤后不可再生，故重建耳蜗感觉上皮结构，促进耳蜗毛细胞再生有望成为治疗感音神经性听力损失的理想手段[2]。大量研究表明，毛细胞再生可能与细胞自身修复，支持细胞和感觉上皮细胞的增殖和转化，以及干细胞的转化密切相关[3]。但毛细胞是否可以再生以及通过何种途径实现再生尚存在争议，故本文将从支持细胞的增殖和转分化、诱导干细胞或者成熟体细胞向毛细胞系转化及毛细胞的自我修复三个方面对毛细胞再生机制的最新研究进展进行归纳和总结。

1 支持细胞的增殖和转分化

在哺乳动物胚胎发育过程中，耳蜗毛细胞和支持细胞有共同的前体细胞，因此支持细胞的增殖和转分化是目前毛细胞再生研究的焦点。原代培养的椭圆囊感觉上皮细胞能产生毛细胞样细胞，且能表达支持细胞的标记物，表明椭圆囊感觉上皮细胞可能是毛细胞再生的前体细胞之一[1]。

鸟类内耳再生实验表明，毛细胞损伤后周围的支持细胞大量增殖，而新生的毛细胞是通过有丝分裂增殖形成[2]，提示新生的毛细胞很有可能是周围的支持细胞分化而来。目前，有研究者通过使用特殊的化学物质或者在小鼠的胚胎中转染Atoh1基因，促进前庭系统中的支持细胞转化为毛细胞[3]，进而缓解听力损失。但结果显示，这种基因治疗具有很多致命的缺陷，首先Atoh1基因过表达会促进Mucin2的表达[4]，而Mucin2是许多粘液性癌的粘液性成分；其次Atoh1基因的过表达与髓母细胞瘤的发生相关。同时有实验证明某种修饰过的Atoh1基因可加速肿瘤的生长速度[5-6]。因此，对于注入基因ATOH1治疗听力损失的安全性还有待考量。另外，细胞基因表达级联与信号转导被认为是决定毛细胞命运的最重要的临床问题[7]。在毛细胞分化过程中，WNTs、FGFs、BMP、Shh和Notch等信号分子发挥了不同的作用。Notch信号和PCP信号在感觉上皮细胞和耳蜗器官会聚性伸展中的中心作用已被确定。Atoh1对于支持细胞分化的影响作用，除了Notch信号外，其他信号也参与了Atoh1的表达调控。例如，Sox2抑制Atoh1的表达并促进Prox1的表达，Prox1是针对新生支持细胞的转录因子[8]。在层状上皮的基底细胞中，p63可维持基底细胞的增殖能力。p63在发育的耳蜗中表达，并诱导Atoh1、Prox1和Hes5的表达，调节听觉上皮细胞的分化，并且p63基因的破坏导致Corti器官中额外的内/外毛细胞出现[9]。NMII集中在缩短的细胞-细胞连接处，是小鼠听上皮会聚延伸所必需的[10]，但NMII在听觉上皮细胞中的作用有待进一步研究确定。故有关耳蜗上皮分层、会聚延伸和前列腺上皮嵌合形成的特异性复杂性机制仍有待阐明。

miRNA因其具有高度保守性和其在细胞内的重要调节作用，是目前医学领域研究热点。其中，miRNA-183家族是位于人类7号染色体上的具有高度保守的miRNA家族的一员，有研究证明miRNA-183对于毛细胞再生有明显的促进作用[11-12]。Notch信号通路通过下调miRNA-183的表达，抑制毛细胞的增殖，从而参与内耳发育和细胞分化的调控过程。同时也有实验分别利用miRNA-182mimics和siRNA在新生大鼠耳蜗前体细胞中过表达和低表达miRNA-182，进而发现miRNA-182可以促进耳蜗前体细胞分化成毛细胞[13]。斑马鱼的毛细胞可以再生而小鼠作为哺乳动物的毛细胞一直以来被认为是不能再生的，分别对斑马鱼和小鼠的毛细胞进行研究，结果发现miRNA对于两种动物模型的毛细胞调控作用一致，此项研究为听力损伤的基因治疗提供了可能性。通过支持细胞的增殖随后产生毛细胞的有丝分裂再生，需要通过基因重编程过程，包括激活β—catenin以上调Wnt信号，缺失Notch1以下调Notch信号，以及新生小鼠耳蜗中的支持细胞Sox2(+)伴随着过表达Atoh1。此外，在Notch1敲除的Sox2(+)细胞中，删除β-catenin后，Notch1缺失诱导的毛细胞增殖消失，这进一步表明Notch信号是Wnt信号转导的上游和负调控因子。通过与正常人耳蜗相比，β—catenin激活、Notch1缺失和β—catenin激活联合Notch1缺失组的转录，鉴定了参与增殖和转分化过程的多个基因，这些基因不是受单个信号传导途径控制，就是受Wnt和Notch联合传导信号的控制[14]。

2 诱导干细胞或者成熟体细胞向毛细胞系转化

对于内耳的干细胞移植注射路径主要有：圆窗、半规管、中阶、蜗轴等，圆窗入路移植和半规管入路移植原理一致，都是通过外淋巴液的流动实现细胞迁移。因为圆窗注射途径与临床操作接近，所以在技术路线上可行性较高[15]。那么主要问题就在能否找到诱导干细胞向毛细胞转化的小分子组合进而可以控制干细胞的信号转导和表达[16]。但是干细胞治疗存在许多局限性：首先是分化成功率比较低，转化成功率仅有1%-2%[17]；其次是干细胞的分化潜能具有不可控性，容易导致肿瘤的产生，因为融合的细胞可能无限的分裂下去；并且移植的干细胞可能与宿主发生排斥反应；最后干细胞可能会向邻近脑组织迁移进而破坏脑组织，因此干细胞治疗感音神经性耳聋还面临许多挑战[18]。于是新的假想出现了：如果用分化成熟的人体细胞完成向毛细胞的转分化是不是就能避免这些问题，有数据表明，基于GPA的治疗能够使成纤维细胞完成向毛细胞的转化[19]。在成熟的耳蜗中，通过高分辨率的转录分离，将Isl1（胰岛因子1）作为一种与Atoh1联合重新编程的因素[20]，是目前比较前沿的转化实验研究。新霉素损伤可以显著增加Lgr5+标记的祖细胞再生成毛细胞的能力，然而新霉素对于Lgr5+标记的祖细胞的增生效果不显著[21]。目前关于Lgr5+祖细胞再生机制并不清楚，只能确定基因在细胞周期的调节中起到了重要作用。目前发现Cdkn1a、Mdm2、Tfdp1和 Wee1基因在 NLPs(neomycin-treated Lgr5+progenitors,新霉素处理Lgr5+祖细胞)中明显上调，而Ccne2、Gadd45g、Nek2、Sfn和Stmn1在ULPs(untreated Lgr5+progenitors,未用新霉素处理的Lgr5+祖细胞)中明显下调。其中Cdkn1a[22]和Mdm2[23]的机制得到了阐明。另外，转录因子也在Lgr5+标记的祖细胞再生中发生变化，在ULPs中，Hes1、Hes5[24]、Hey1[25]、HeyL[26]、Id1、Id2 和Id3[27]表达明显下调。同时也发现miRNAs对于毛细胞的保护和再生有重要的意义，在NLPs中miR466i表达上调，而 miR7007、mmu-miR-703、miR107、miR361、miR6918、miR6982和miR3099表达下调[28]。Shh、Hippo和TGFβ三个信号通路对于内耳细胞的发育很重要[29-31]。

Sox2是控制毛细胞所必需的细胞因子，Sox2可通过激活Atoh1进而影响毛细胞的形成和成熟[32]。此外，Sox2单倍体不足和损伤是β—catenin诱导新生耳蜗的过渡细胞（从支持细胞向毛细胞样细胞直接表型转化的细胞）增殖和形成的允许信号[33]。研究表明，Sox2在分化毛细胞中的下调取决于Six1活性，Six1发生突变后可导致耳蜗中整个器官发育障碍[34]。在耳蜗器官分化过程中，维持Fgf8的表达及N-cadherin和E-cadherin的动态分布需要Six1[35]，且Six1基因剂量可能对内毛细胞和外毛细胞的发育有不同的影响。运动蛋白肌球蛋白II调节Corti器官的延伸以及毛细胞和支持细胞排列成有序的行。胶原受体DDR1与小鼠内耳非肌肉肌球蛋白IIA共定位，有助于运动细胞的构筑和稳定性。已经确定DDR1和NM-IIA共同定位在螺旋韧带的III型纤维细胞（张力纤维细胞）、OHCs和内毛细胞的立体纤毛中，且DDR1与肌动蛋白/肌球蛋白复合物的蛋白质协同，以维持内耳的机械力，并稳定OHC细胞形状，以便进行适当的听觉信号传导[36]，这是蛋白质组合疗法的新思路。

3 毛细胞的自我修复

毛细胞的自我修复虽然在人类中没有具体的研究，但是在蜥蜴的囊胚中，庆大霉素能够诱导毛细胞损伤后的恢复与再生[37]，这表明，在外突和纹状体出现感觉上皮修复和毛细胞再生，其中恢复主要通过支持细胞的增殖或者是毛细胞的自我修复实现。感觉上皮的细胞增生也是有限的，故毛细胞的自我修复是毛细胞再生的一个重要机制。胰岛素、FGF2和EGF几种营养因子的协同作用对毛细胞损伤丢失后的修复存在一定的影响。

4 小结

再生疗法的当前策略是通过基因和药物治疗实现内耳毛细胞再生，替换受损的内耳细胞（细胞疗法）。因此，目前可能尚无在活体内毛细胞再生的技术手段，但是对于耳蜗毛细胞再生和毛细胞修复的基因研究我们已经取得了突破，也许未来可以结合耳内镜的探测技术和基因研究机制的突破，在耳蜗毛细胞再生研究领域将取得突破性进展。