发酵条件对雪茄芯叶TSNAs及其前体物含量变化的影响

李晶晶，史宏志，杨兴有，周骏，白若石，秦艳青，阳苇丽

1 河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室/烟草农业减害研究中心，郑州市金水区文化路95号 450002；

2 上海烟草集团北京卷烟厂，北京市通州区万盛南街99号 100024；

3 四川省烟草公司，成都市高新区世纪城路936号 600041；

4 四川省烟草公司达州市公司，达州市达川区七里沟 635000

近年来，由于国际控烟的影响和国内消费升级的提速，具有香气醇厚丰满、满足感强、有害成分含量低等特点的雪茄烟异军突起，为广大消费者所接受，具有良好的市场发展前景[1]。雪茄烟由茄衣、茄套和茄芯三部分组成[2]，其中茄芯是雪茄烟的核心组分，对雪茄口味的贡献率可达65%～70%[3]，决定了雪茄烟吸食过程中的香味风格和整体层次[4]。目前，我国主要的雪茄芯叶产区有四川德阳、达州、海南儋州、湖北来凤[5]。发酵是雪茄烟叶特有的初加工工艺，调制后的新烟需经过3～5周的高温发酵和18～36个月的醇化来改善烟叶品质[6]。但同时发酵也是烟叶中一类重要有害物质烟草特有亚硝胺（TSNAs）产生和积累的重要时期，初步分析表明，发酵后雪茄烟叶的TSNAs含量比发酵前的烟叶大幅升高[7-8]。关于TSNAs的形成规律和机理，在其他类型烟草中已有较为系统的研究，主要是烟叶调制和贮藏过程中生物碱类物质与亚硝基反应生成的复合物[9-10,11,12]。在雪茄烟发酵过程中，发酵温度、湿度是影响烟叶质量变化的关键因素，同时也会对烟草特有亚硝胺的形成产生互作影响，但目前该方面研究较为欠缺。本研究通过在人工控制条件下设置不同发酵温度与湿度互作试验，分别在发酵前后取样，探究环境温度和湿度对烟叶TSNAs形成的影响，以明确不同因子对雪茄芯叶发酵过程中TSNAs形成的贡献，为抑制发酵过程中TSNAs的形成与积累提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试品种为传统雪茄芯叶什烟1号。供试烟叶为四川省烟草公司提供的2017年调制后质量均匀一致的上一等级烟叶。

1.2 试验设计

试验地点位于河南农业大学烟草学院烟草栽培实验室，试验设置发酵温度和发酵湿度2个因素，发酵温度设置39℃、42℃、45℃和48℃ 4个水平，发酵湿度设置70%、80%和90% 3个水平，共12个处理，每个处理重复三次。

取样：自发酵之日开始取样，每隔4天取样一次，至20 d后结束发酵取完发酵后样品为止。取得的样品冷冻干燥后磨碎过孔径0.25 mm的筛，留取混合样品测定TSNAs及其前体物生物碱和硝酸盐含量。

1.3 样品测定方法

TSNAs含量由上海烟草集团北京卷烟厂进行检测。测定方法为在线SPE-液相色谱质谱联用（SPELC-MS/MS）法（SPE-LC: Spark Holland,Symbiosis Pico）；（MS/MS: AB Sciex triple quad 5500）[13]。

生物碱测定参照Jack和Bush[14]的方法。

硝酸盐含量测定采用戴亚和方力[15]的方法。

1.4 数据分析

试验数据用 Excel 2010，SPSS 22.0 与 Origin 8.0进行统计分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 烟叶发酵前后4种TSNA及其总量的变化

2.1.1 发酵条件对烟叶4种TSNA含量的影响

图1 不同发酵条件下烟叶4种TSNA含量变化Fig.1 Changes of 4 TSNA contents in tobacco leaves under different fermentation conditions

由图1和表1可知，温度相同时，4种TSNA含量随环境湿度的增加显著降低；同一湿度条件下，发酵后烟叶4种TSNA含量在39℃～42℃变化不大，42℃之后随温度的升高逐渐增加；在48℃-RH 70%条件下，NNN、NNK、NAB、NAT含量分别达到最大值2237.24 ng/g、155.66 ng/g、109.61 ng/g、2737.74 ng/g。相关分析结果表明，发酵过程中环境湿度与NNN、NNK、NAB、NAT的含量存在显著的负相关关系，贡献率分别为38.10%、70.31%、48.39%和48.79%，其中对NAT的影响达到极显著水平。温度主要影响了NNN和NNK的积累，对其含量的贡献率达37.08%和48.48%。二者的交互作用对四种TSNA的影响较小。在此基础上进行逐步回归分析（表2），结果显示在本试验条件下，发酵过程中4种TSNA含量变化的91.01% ～ 99.03%可由发酵温度和湿度共同揭示。

2.1.2 发酵条件对烟叶TSNAs总量的影响

由图1-E可以看出，同一湿度条件下，各处理烟叶的TSNAs含量随温度的增加逐渐升高，而同一温度条件下则随着湿度的增加呈下降趋势，此外，低于42℃条件下，TSNAs的含量变化比较缓慢，温度超过42℃之后，随温度的升高烟叶TSNAs含量显著增加，且增长幅度随湿度降低而升高。对各处理烟叶的TSNAs含量进行相关分析（表1），结果显示影响烟叶TSNAs含量的主要因素是发酵湿度，贡献率为57.01%，其次是温度，贡献率28.33%，二者的交互作用仅为 14.66%。回归方程 m=3461.67+315.28 t -1491.80 h +186.08 t2+392.20 h2-395.71 t*h（R2=0.9799），说明本试验条件下，发酵过程中TSNAs含量变化有97.99%归因于温湿度的作用。

表1 不同发酵条件烟叶TSNAs含量的相关系数及差异性分析Tab.1 Correlation coefficient and difference analysis of TSNAs content in tobacco leaves under different fermentation conditions

表2 不同发酵条件烟叶TSNAs含量的变化趋势Tab.2 Variation of TSNAs content in tobacco leaves under different fermentation conditions

2.2 发酵条件对烟叶4种TSNA及其总量的变化量

不同发酵条件下各处理烟叶4种TSNA及其总量均大幅增加（表3），且各处理间差异显著。湿度相同时，随温度增加，烟叶4种TSNA及总TSNAs增加量显著上升，同一温度下随湿度增加则表现为相反的变化趋势。总TSNAs含量在48 ℃-RH 70%时增加量最高，为 3913.46 ng/g，增幅294.96%，42 ℃ -RH 90%时最低，为182.82 ng/g，增幅13.78%，其余处理增幅多集中在40% ～100%。48℃-RH 70%条件下发酵的烟叶4种TSNA增加量最大，增幅在143.70% ～464.42%之间，其中NNN增幅最大，NNK增幅最小。变化幅度最低的处理是42℃-RH 90%，此条件下烟叶增幅不超过20%。

表3 烟叶发酵前后TSNAs变化量的方差分析Tab.3 Analysis of variance of TSNAs variation quantitybefore and after tobacco fermentation

表4 不同温湿度条件发酵后烟叶生物碱和硝酸盐含量Tab.4 Content of alkaloids and nitrate in tobacco leaves during the fermentation process under different temperature and humidity conditions %

2.3 不同温湿度条件对生物碱和硝酸盐含量的影响

表4显示了不同温湿度条件发酵后烟叶TSNAs的前体物生物碱和硝酸盐的含量。由表可知，发酵后烟叶中的烟碱及生物碱总量随温度的增加先降低后升高，随湿度的增加逐渐上升；硝酸盐含量与TSNAs的变化规律相反，均表现为同一湿度条件下随温度的增加逐渐降低，而同一温度条件下随着湿度的增加呈上升趋势，对各处理烟叶的生物碱总量和硝酸盐含量进行方差分析，除假木贼碱外，各处理差异均达到极显著水平，且发酵温度、湿度及其交互作用均对硝酸盐含量的影响最大，其次是生物碱总量。

表5 不同温湿度条件发酵后烟叶生物碱和硝酸盐含量方差分析表Tab.5 Variance analysis of alkaloid and nitrate contents in tobacco leaves fermented under different temperature and humidity conditions

3 讨论与结论

发酵是雪茄烟叶独特的调制后加工环节，也是雪茄烟TSNAs形成不容忽视的时期。本试验研究结果表明，发酵后烟叶TSNAs含量显著增加，其前体物生物碱和硝酸盐类物质显著减少，且随发酵湿度的增加，烟叶TSNAs的增加量持续下降，各处理之间的差异达到极显著水平，这与前人的研究结果一致[16]。相关分析等结果显示，发酵湿度对烟叶TSNAs含量的影响最大，贡献率达57.01%，结合TSNAs前体物生物碱和硝酸盐含量的变化趋势，推测可能是由于高湿环境下，烟叶中的硝态氮为水溶态而相对稳定，不易生成挥发性亚硝酸盐或NO等气态氮氧化物，与生物碱反应产生的TSNAs含量随之减少。

基于雪茄烟堆垛发酵过程中容易产生高温的情况，本文选取39 ～ 48℃温度段进行试验。研究结果表明，在3种环境湿度条件下，烟叶4种TSNAs及其总量均与发酵温度呈正相关，随着发酵温度的升高显著增加，这与SHI等[17]的研究结果一致。当温度低于42℃时，烟叶TSNAs含量积累缓慢，温度超过42℃后，烟叶TSNAs含量显著增加，这可能是由于高温促进硝酸盐类物质发生亚硝化反应，进而与生物碱反应造成TSNAs累积，也可能是因为在高温条件下促进了硝态氮向气态氮氧化物的形成。这也是我们下一步的研究重点。根据本试验的研究结果，在温度低于45℃、湿度高于80%条件下发酵后烟叶TSNAs增加量较小，因此，适当降低发酵温度或增加发酵湿度是抑制发酵过程中TSNAs产生和积累的有效手段。