烟叶中游离态和结合态有机酸含量分析

余晶晶，王冰，蔡君兰，郭吉兆，牛佳佳，吴晶晶，秦亚琼，刘绍锋，李小兰，王宜鹏，杨松，张晓兵*

1 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州 450001；

2 广西中烟工业有限责任公司，广西壮族自治区南宁 530000

烟叶中含有各种各样的有机酸，按照挥发性可分为挥发性有机酸、半挥发性有机酸和不挥发性有机酸；按照化学结构可分为脂肪酸和其他有机酸（包括芳香酸、羟基酸等）。烟叶中有机酸含量一般为干物重的12%～16%，具有独特的香气和酸性，特别是挥发性有机酸。有机酸不仅是卷烟香气质量和风格特征的重要组成部分，还可以改变烟气的酸碱平衡，进而对卷烟的劲头、刺激性和口感等方面产生明显的影响作用[1-3]。

烟草中有机酸具有游离态和结合态，而结合态又可再细分为盐类结合态（烟碱盐、金属盐等）和酯（糖酯、脂肪酸酯等）。文献报道的烟叶中的有机酸提取方法主要有加速溶剂萃取法[4]、索氏提取法[5]、加热超声萃取法（50～60℃）[6]等，这些提取条件均较剧烈，可能会伴随脂肪酸酯、部分脂肪酸前体物的热裂解反应。因此，这些方法不仅提取了游离态有机酸，还包含有部分有机酸盐类结合态和酯。另外，目前有机酸总量的研究主要集中在高级脂肪酸[7-9]，通常首先采用皂化的方法使得烟叶中高级脂肪酸游离出来，然后测定高级脂肪酸总量。例如，Ellington等[9]采用了强碱溶液对烟叶进行皂化处理，由于皂化后的溶液为水相体系，采用H2SO4-甲醇溶液进行甲酯化衍生反应，并采用GC-MS法测定烟叶中高级脂肪酸的总量。然而，由于低级脂肪酸甲酯的沸点低，且质谱灵敏度响应较低，甲酯化衍生的方法不适合挥发性有机酸的测定[9-11]；而不同的有机酸硅烷化衍生后灵敏度均较高，因此硅烷化衍生的方法可适用于挥发性、半挥发和不挥发有机酸的分析[4-6]。另外，烟草行业已有标准方法YC/T 500-2014[12]采用了丙酮振荡萃取烟叶样品中的挥发性有机酸，然后选用极性色谱柱-GC-MS分析，该方法中低级脂肪酸，如甲酸、乙酸、丙酸色谱峰拖尾严重。

为考察烟叶中不同形态有机酸含量差异，本文分别建立了烟叶中有机酸游离态和盐类结合态的分析方法和烟叶皂化后测定有机酸总量的分析方法。本文研究的主要为挥发性和半挥发性有机酸，为简便称之为有机酸，但不包括多元酸等不挥发性和难挥发性有机酸。

首先采用了较温和的提取方法—烟叶调整pH值-溶剂萃取法，使盐类结合态的有机酸游离出来，接着采用溶剂萃取，并结合硅烷化衍生-GC-MS/MS法，实现了烟叶中33种有机酸（8种短链脂肪酸、7种中链脂肪酸、10种长链脂肪酸和8种其他有机酸）游离态和盐类结合态总量的测定。采用皂化法将烟叶中有机酸游离态、有机酸盐类和酯均转化为强碱盐，然后采用酸中和使得有机酸游离出来，结合硅烷化衍生化-GC-MS/MS技术测定不同形态有机酸的总量。采用所建立的方法对不同类型烟叶皂化前后有机酸含量的差异进行了比较研究。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

标准品：异丁酸、2-甲基丁酸、2-丁烯酸、戊酸、惕格酸、己酸、庚酸、辛酸、癸酸、十七酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸、十九酸、二十酸（纯度均＞98.0%，加拿大TRC公司）；3-甲基戊酸、2-辛烯酸、十四酸、苯甲酸、3-苯基丙酸、2-羟基苯甲酸（纯度均＞97.0%，日本TCI公司）；12-甲基十四烷酸（纯度均＞98.0%，Sigma公司）、十六酸（纯度均＞99.0%，阿拉丁公司）、乙酰丙酸（纯度均＞98.0%，北京伊凯诺公司）、苯乙酸（纯度均＞95.0%，key organics公司）；间甲基苯甲酸（纯度均＞97.0%，Accela上海韶远公司）；4-甲基戊酸、壬酸、十一酸、月桂酸、2-呋喃甲酸、肉桂酸（纯度均＞98.0%，百灵威公司）。

试剂：甲醇（HPLC级，美国Fisher公司）；二氯甲烷（AR级，美国Acros Organics公司）；氢氧化钾（国药集团化学试剂有限公司）；磷酸（AR级，天津科密欧试剂开发中心）；N,O-双（三甲硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）（美国Fluka公司）。实验用水为GB/T 6682规定的一级水。

仪器：气相色谱串联质谱仪（美国Thermo Fisher scientific公司，Trace 1310 GC-TSQ Quantum XLS）；CP2245电子天平（感量0.0001 g，德国Sartorius公司）；数显型旋涡混合器（美国TALBOYS Advanced Multi-Tube Vortexer）；德国SIGMA 3-30KS离心机；pH计（瑞士Metrohm万通，702 SM Titrino）。

样品信息：选取代表性烟叶样品33个进行分析，具体样品信息如表1所示。

表1 样品信息表Tab.1 Sample information

1.2 标准溶液配制与标准曲线制作方法

实验采用反-2-己烯酸为内标，内标浓度为0.5 μg/mL。分别称取一定量有机酸标准品于10 mL容量瓶中，采用含有内标（0.5 μg/mL反式-2-己烯酸）的二氯甲烷配制成单标母液。取一定量不同有机酸单标母液，加入10 mL容量瓶中，配制标线最高浓度混标，并通过逐级稀释制作标准曲线。标准曲线制作过程中均采用含有内标的二氯甲烷溶液稀释，以内标法定量。

1.3 样品的前处理

采用皂化-硅烷化法，测定有机酸游离态、有机酸盐类和酯类的总量。采用调整pH 值后萃取-硅烷化法，测定有机酸的游离态和盐类结合态总量。

1.3.1 烟叶皂化-硅烷化法的前处理过程

取 1.0 g 烟末，精确到 0.001 g，准确加入 0.5 mol/LKOH 的甲醇溶液 50 mL，65℃水浴反应 2 h。取25 mL皂化后的溶液进行旋转蒸发浓缩干，浓缩瓶中加入1.0 mL水进行复溶，将复溶后的混合物转移至50 mL离心管中，浓缩瓶中再加入1.0 mL水和1.0 mL磷酸，混合后逐滴加入上述50 mL离心管中（冰水浴），将混合物pH调整至约为2.0。加入15 mL含内标（0.5 μg/mL反式-2-己烯酸）的二氯甲烷溶液，涡旋萃取 20 min（2500 rpm），然后离心 3 min（8000转），静置2 min。取1.0 mL二氯甲烷溶液，加入 200 μL BSTFA，60℃水浴衍生反应 40 min，进GC-MS/MS仪器分析。

1.3.2 烟叶调整pH值后萃取-硅烷化法的前处理方法

将 60 g NaH2PO4·2H2O 溶于 90 mL 水中，再加入9.5g 85% H3PO4配成泡发液。取 2.0 g烟末，精确到0.001 g，加入 3.0 mL 泡发液后静置 30 min。烟叶 pH值约为 2.5。然后加入 15 mL 含内标（0.5 μg/mL 反式-2-己烯酸）的二氯甲烷溶液，进行涡旋萃取和硅烷化衍生反应，后续操作同1.3.1。

1.4 仪器条件

有机酸经硅烷化衍生后为非极性化合物，选择DB-5MS 石英毛细管柱（60 m×0.25 mmi.d.×0.25 μm d.f.）；进样口280℃；进样量1 μL；分流比10:1；恒流模式，流速1 mL/min；载气：氦气；溶剂延迟:6 min；程序升温为：初温40℃保持3 min，以4℃/min升至280℃，保持20 min。离子源为电子轰击（EI），扫描方式为全扫描和选择离子扫描同时进行，离子源温度为300℃，传输线温度为280℃，四级杆温度为180℃。目标物为33种有机酸，包括短链脂肪酸（8种）、中链脂肪酸（7种）、长链脂肪酸（10种）、其他有机酸（8种），各有机酸保留时间、碰撞能、定性定量离子见表2。

2 结果与讨论

2.1 烟叶皂化-硅烷化测定有机酸总量分析方法的建立

为测定烟叶中有机酸的总量，采用KOH-甲醇溶液对烟叶进行皂化处理，并进行衍生化反应后采用GC-MS/MS技术进行分析，所测得的有机酸含量简称为皂化总量。

考察了甲酯化和硅烷化两种衍生方法。其中，烟草行业标准方法YC/T 288-2009[13]即采用硫酸-甲醇回流进行甲酯化衍生以测定烟草及烟草制品中多元酸（草酸、苹果酸和柠檬酸）。由于短链脂肪酸含量较低，且短链脂肪酸甲酯的质谱灵敏度较低，采用甲酯化衍生后，色谱出峰较少，主要为长链脂肪酸和多元酸（乙二酸、苹果酸、柠檬酸等），而大量的短链脂肪酸，如对烟叶香味有重要影响的2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、3-甲基戊酸等均未检出。然而，硅烷化衍生的方法能大大提高有机酸的质谱灵敏度[4-6]，可满足多种有机酸皂化总量的测定。为了实现烟叶皂化后溶液的硅烷化衍生反应，在皂化结束后对溶液进行浓缩，以除去甲醇，然后在冰水浴条件下采用磷酸进行中和，使得有机酸游离出来，然后采用二氯甲烷对有机酸进行萃取，最后进行硅烷化衍生分析。实验结果表明采用皂化-硅烷化的方法可实现烟叶中多种有机酸总量的定性定量分析。

烟叶中葡萄糖、果胶和纤维素占烟叶干重均为7%～8%左右，为考察它们在皂化过程是否会产生干扰，实验中对葡萄糖、果胶、纤维素进行了同样的实验，即分别取0.1 g葡萄糖、果胶、纤维素的标准品，按照1.3.1烟叶皂化-硅烷化法的前处理过程进行反应，并对反应产物进行了定性定量分析，结果如表3所示。结果表明，葡萄糖、果胶和纤维素在硫酸-甲醇回流反应后均能产生大量的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸和3-羟基丙酸。可见，本文中皂化-硅烷化法的前处理过程使得葡萄糖、果胶和纤维素反应产生了大量的有机酸。因此，皂化-硅烷化的方法不适合烟叶中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸和3-羟基丙酸总量的分析。

因此，本文采用皂化-硅烷化法测定烟叶中33种有机酸（表2，包括8种短链脂肪酸、7种中链脂肪酸、10种长链脂肪酸、8种其他有机酸）的皂化总量，对皂化反应的产率和精密度进行了考察。选择几种典型的酯（2-甲基丁酸乙酯、庚酸乙酯、苯甲酸异戊酯、辛酸异戊酯、苯乙酸异戊酯、肉桂酸苯乙酯、十二酸甲酯、十四酸异丙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、十八酸乙酯）在低、中、高三个不同浓度水平进行加标，测定酯皂化后酸的产率。结果表明，所对应的酸的皂化-硅烷化衍生的产率在76.4%～109%之间，其中长链脂肪酸产率较高，均大于99.0%。另外，选取典型烟叶样品，进行方法日内及日间精密度实验。在同一天中，对所选样品一天内进行5平行实验以考察方法日内精密度，对所选样品连续5天进行实验以考察方法日间精密度，结果见表4。结果表明，皂化-硅烷化测定烟叶中33种有机酸总量的方法日内、日间精密度均小于14.9%。

表2 有机酸保留时间、碰撞能、定性定量离子对Tab.2 Retention time,collison energy,qualitative and quantitative ion of organic acids

表3 葡萄糖、果胶、纤维素硫酸-甲醇回流实验结果Tab.3 Result of H2SO4-CH3OH reflux reaction of sugar,pectin and cellulose μg/g

2.2 烟叶调整pH值后萃取-硅烷化测定有机酸分析方法的建立

由于烟叶中有机酸和有机酸盐类结合态存在平衡状态，为实现烟叶中有机酸和有机酸盐类结合态的完全萃取，将烟叶pH值调整至酸性并进行泡发，使得有机酸盐类结合态游离出来，然后再采用二氯甲烷萃取有机酸游离态，进行硅烷化衍生后GC-MS/MS分析，所测得的有机酸含量简称为萃取量。

为考察方法的准确性，对方法的回收率和精密度进行了考察。对烟叶样品中有机酸游离态和盐类结合态回收率分别进行了考察。结果表明33种有机酸平均回收率在88.2～110%之间。另外，以庚酸钠、辛酸钠、苯甲酸钠、肉桂酸钠、十四酸钠、油酸钠、硬脂酸钠为代表，考察本方法中有机酸盐类结合态的回收率，结果表明有机酸盐类结合态回收率在92.6%～103%之间。因此，本方法采用对烟叶调整pH值并进行泡发后萃取，能将烟叶中有机酸游离态和盐类结合态完全萃取出来。另外，进行方法日内及日间精密度实验，结果见表4，日内、日间精密度均小于11.2%。

2.3 方法检测限及定量限

本文分别采用烟叶皂化-硅烷化法和烟叶调整pH值后萃取-硅烷化法测定有机酸的皂化总量和萃取量。由于两种方法前处理方法不同，仪器方法相同，因此方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）相同，对方法的检测限和定量限进行了考察。取最低浓度标准工作溶液，采用GC-MS/MS仪器进行分析10次平行测定，计算标准偏差，以3倍标准偏差为检测限，10倍标准偏差为定量限，结果如表4所示。其中，十六酸、十七酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸和十九酸的检出限在10.3～140 ng/mL之间，其他有机酸检出限均低于10 ng/mL。

表4 方法日内日间精密度、检测限、定量限Tab.4 Intra-day and inter-day precision,LOD,LOQ of the developed methods

续表4

2.4 典型烟叶样品中有机酸皂化总量和萃取量测定结果

选择一个典型烤烟烟叶样品，采用所建立的方法测定样品中33种有机酸的皂化总量和萃取量，结果如表5所示，结果表明烟叶皂化总量显著高于萃取量。对皂化总量与萃取量计算比值，结果见表5，二者比值反映了对应的有机酸酯含量的高低，不同的有机酸比值差异很大。其中，短链、中链、长链脂肪酸和其他有机酸两种方法测得含量的比值分别在1.3～70.7倍、2.4～12.8倍、4.7～7.7倍、1.7～45.1倍之间。例如，2-甲基丁酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸二者比值分别为70.7、20.3、10.0倍，主要是由于这些酸在烟叶中主要以糖酯的形式存在[14-16]，皂化反应使其游离出来。另外，长链脂肪酸如十六酸、硬脂酸、十九酸、二十酸二者比值分别为5.1、5.0、6.1、4.9倍，可见，烟叶中长链脂肪酸酯含量较高，在卷烟燃烧过程中会裂解产生相应的长链脂肪酸。

表5 典型烤烟烟叶样品中有机酸皂化总量和萃取量Tab.5 Saponification and extraction amounts of organic acids in typical flue-cured tobacco leaf samples

续表5

2.5 不同类型烟叶中有机酸皂化总量和萃取量差异分析

采用所建立的烟叶皂化-硅烷化测定有机酸皂化总量和烟叶调整pH值后萃取-硅烷化测定有机酸的方法对33个不同类型烟叶样品有机酸含量进行测定，包括29个烤烟C3F样品，2个白肋烟样品，1个香料烟和1个晒红烟样品，具体样品信息见表1。对不同类型烟叶样品测定结果求平均值后进行比较分析，同时由于烟叶中不同有机酸含量差异很大，为了便于比较，对测定值进行最大值归一化作图，结果见图1～图8所示。

图1所示为不同类型烟叶样品中短链脂肪酸皂化总量和萃取量的比较图，图2所示为不同类型烟叶短链脂肪酸皂化总量与萃取量的比值图。由图1可知，不同类型烟叶样品中短链脂肪酸的皂化总量均明显高于萃取量。另外，香料烟的异丁酸、2-甲基丁酸、惕格酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、己酸的皂化总量为四种类型烟叶最高。由图2可知，香料烟中所有短链脂肪酸的皂化总量与萃取量比值均为四种类型烟叶中最高。其中，香料烟中皂化总量与萃取量比值高于50倍的有4-甲基戊酸、3-甲基戊酸、2-甲基丁酸、惕格酸、异丁酸，其中比值最高的为4-甲基戊酸，3-甲基戊酸、2-甲基丁酸次之。这与香料烟的糖酯含量高有关，而糖酯结合的主要为短链脂肪酸，如异丁酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸等，它们在卷烟燃烧时被裂解释放出来，形成香料烟烟气的主要特征香气，对烟叶皂化处理后可将糖酯中结合的短链脂肪酸游离出来。

图1 不同类型烟叶中短链脂肪酸的皂化总量和萃取量Fig.1 Saponification amount and extraction amount of short-chain fatty acids in different types of tobacco leaves

图2 不同类型烟叶短链脂肪酸皂化总量与萃取量的比值图Fig.2 Ratio of saponification and extraction amounts of short chain fatty acids in different types of tobacco leaves

图3 不同类型烟叶中链脂肪酸皂化总量和萃取量的比较图Fig.3 Saponification and extraction amounts of medium-chain fatty acids in different type tobacco

图4 不同类型烟叶中链脂肪酸皂化总量与萃取量的比值图Fig.4 Ratio of saponification and extraction amounts of medium chain fatty acids in different type tobacco leaves

图5 不同类型烟叶长链脂肪酸皂化总量和萃取量的比较图Fig.5 Saponification and extraction amounts of long chain fatty acids in different type tobacco leaves

图6 不同类型烟叶长链脂肪酸皂化总量与萃取量的比值图Fig.6 Ratio of saponification and extraction amounts of long chain fatty acids in different type tobacco leaves

图3为不同类型烟叶中链脂肪酸皂化总量和萃取量的比较图，图4所示为不同类型烟叶中链脂肪酸皂化总量与萃取量的比值图。由图3可知，不同类型烟叶样品中中链脂肪酸的皂化总量均明显高于萃取量。四种类型烟叶中，晒红烟中辛酸、2-辛烯酸、壬酸、癸酸的皂化总量最高，香料烟中庚酸和月桂酸皂化总量最高，烤烟中十一酸皂化总量最高。由图4可知，不同类型烟叶中链脂肪酸皂化总量与萃取量的比值无规律性差异，例如烤烟中庚酸、壬酸、癸酸、十一酸比值最大（高于5倍），晒红烟中辛酸和月桂酸比值最大（高于10倍）。

图5为不同类型烟叶长链脂肪酸皂化总量和萃取量的比较图，图6所示为不同类型烟叶长链脂肪酸皂化总量与萃取量的比值图。由图5可知，不同类型烟叶样品中长链脂肪酸的皂化总量基本均高于萃取量，但白肋烟中十九酸皂化总量与萃取量相当。四种类型烟叶中，香料烟中十四酸、12-甲基十四烷酸、十七酸、二十酸皂化总量最高，烤烟中十六酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸皂化总量最高，晒红烟中十九酸皂化总量最高，白肋烟中所有长链脂肪酸皂化总量均为最低。由图6可知，不同类型烟叶中，烤烟的长链脂肪酸（除十六酸外）皂化总量与萃取量比值最高，晒红烟次之，香料烟和白肋烟较低。其中，烤烟的长链脂肪酸皂化总量与萃取量比值高于5倍的有十四酸、十六酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸、十九酸。

图7 不同类型烟叶其他有机酸皂化总量和萃取量的比较图Fig.7 Saponification and extraction amounts of other fatty acids in different type tobacco leaves

图8 不同类型烟叶其他有机酸皂化总量与萃取量的比值图Fig.8 Ratio of saponification and extraction amounts of other fatty acids in different type tobacco leaves

图7为不同类型烟叶其他有机酸皂化总量和萃取量的比较图，图8所示为不同类型烟叶其他有机酸皂化总量与萃取量的比值图。由图7可知，不同类型烟叶样品中其他有机酸的皂化总量基本均高于萃取量。四种类型烟叶中，香料烟中2-呋喃甲酸、间甲基苯甲酸、3-苯基丙酸、2-羟基苯甲酸、肉桂酸皂化总量最高，烤烟中乙酰丙酸皂化总量最高，白肋烟中苯甲酸、苯乙酸皂化总量最高。由图8可知，不同类型烟叶中，烤烟其他有机酸的皂化总量与萃取量比值基本最高，其中比值高于10倍的有乙酰丙酸和肉桂酸。

综上所述，四种类型烟叶中，香料烟中短链脂肪酸酯（主要为糖酯）含量最高，烤烟中长链脂肪酸酯和其他有机酸酯含量最高。

3 结论

本文建立了基于硅烷化-GC-MS/MS法的烟叶中有机酸的皂化总量和萃取量的分析方法，能定性定量分析烟叶中33种有机酸，包括8种短链脂肪酸、7种中链脂肪酸、10种长链脂肪酸、8种其他有机酸。烟叶皂化-硅烷化-GC-MS/MS法中酯的回收率在76.4～109%之间，其中长链脂肪酸酯回收率均大于99.0%，方法日内、日间精密度均小于14.9%。在烟叶中加入有机酸和有机酸盐标样来考察烟叶调整pH值后萃取-硅烷化-GC-MS/MS法的回收率分别在88.2～110%和92.6～103%之间，表明本方法能将烟叶中有机酸游离态和盐类结合态萃取完全；方法的日内及日间精密度均小于11.2%。方法的检出限较低，其中，十六酸、十七酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸和十九酸的检出限在10.3～140 ng/mL之间，其他有机酸检出限均低于10 ng/mL。

烟叶样品测定结果表明烟叶皂化总量显著高于萃取量，且不同的有机酸皂化总量与萃取量比值差异很大，其中2-甲基丁酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸皂化总量为萃取量的10倍以上，主要是由于这些酸在烟叶中主要以糖酯的形式存在。另外，四种类型烟叶中，香料烟的短链脂肪酸，如异丁酸、2-甲基丁酸、惕格酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、己酸的皂化总量为四种类型烟叶最高；烤烟中长链脂肪酸和其他有机酸，如十六酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸、乙酰丙酸皂化总量最高。