KNDy神经元在绝经后期妇女血管舒缩症状病理机制中的作用*

刘静，陈赟，卢苏

（1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学附属医院 妇科，江苏 南京 210029）

绝经后期女性会经历一系列的绝经相关症状，例如情绪紊乱、睡眠中断、注意力不集中、疲劳、认知障碍、阴道萎缩、体重增加等。这些症状会严重影响女性的生理及心理健康，其中血管舒缩症状（vasomotor symptoms, VMS）最为典型。接近80%的女性在绝经后期会经历VMS，主要表现为潮热出汗，并且约55%的女性在月经周期发生变化之前已经出现潮热症状[1]。潮热是主观的热感觉，与皮肤血管舒张及核心温度下降有关。潮热症状的严重程度、频率和持续时间具有个体差异并且可能加重抑郁，潮热与睡眠差、情绪波动大、生活质量下降有关[1]。尽管潮热症状已经严重影响现代女性健康，但对潮热发生的潜在机制了解较少。目前绝经后期妇女VMS 治疗指南推荐激素替代治疗（hormone replacement therapy, HRT）作为一线治疗方案，能够缓解75%患者的潮热症状，但是长期应用HRT 会增加乳腺癌、子宫内膜癌、静脉血栓、缺血性脑卒中等疾病的发生风险[2]。因此，迫切需要一种安全有效的新疗法，非激素疗法对有雌激素禁忌的女性尤其有价值。为探索新的治疗靶点，了解支撑生殖轴的神经内分泌回路，以及该回路在绝经后期是如何变化的至关重要。研究绝经前后妇女下丘脑组织的形态发现，绝经后期漏斗状核神经元亚群肥大，这些肥大的神经元表达雌激素受体（ERα）、Kisspeptin和Neurokinin B（NKB），同时伴有NKB 和Kisspeptin基因表达的增加。并且Dynorphin 神经元也表现肥大，但表达Dynorphin mRNA 的神经元数量减少[3]。KISS1编码的Kisspeptin、TAC3 编码的NKB 及PDYN 编码的Dynorphin A 共同表达于哺乳动物的下丘脑弓状核（arcuate nucleus, ARC）中，简称为KNDy 神经元[4]。由于下丘脑KNDy 神经元的形态及神经肽基因表达的变化继发于卵巢功能衰退，有研究发现雌激素可以抑制去卵巢的绵羊、山羊及大鼠ARC 中的NKB 和Kisspeptin基因的表达[3]。该研究使KNDy 神经元在潮热机制中起重要作用的假说得以发展。

1 神经内分泌网络中的KNDy 神经元

2003年的2 项开创性实验明确Kisspeptin 的生理作用，SEMINARA 等[5]发现编码Kisspeptin 受体G 蛋白偶联受体54（G protein-coupled receptor 54, GPR54）的基因突变导致低促性腺素性功能减退症。随后研究[6]证实，Kisspeptin 与其受体GPR54 之间的信号传导是正常生育所必需的，GPR54 特异性缺失的小鼠表现为青春期启动失败、性腺体积小、泡刺激素水平降低和促性腺激素释放激素GnRH（gonadotropinreleasing hormone）神经元对Kisspeptin 没有反应。与此相反的是，当选择性地将功能性GPR54 重新引入GnRH 神经元中，小鼠的生育能力得以恢复，并且恢复Kisspeptin 对GnRH 神经元的刺激作用[6]。因此，Kisspeptin 阳性传入GnRH 神经元被认为是维持生育所需的GnRH 脉冲释放的关键性因素，即通过GPR54激活GnRH 神经元，进而刺激黄体生成素的脉冲释放。在实验中被敲除KISS1 的大鼠和使用KISS1R 拮抗剂的去卵巢母羊的LH 脉冲释放均被阻断，为以上的假说提供证据[7-8]。解剖学研究发现哺乳动物的下丘脑中有2 个区域高密度表达Kisspeptin，啮齿动物的第三脑室吻侧室周区或其他哺乳动物的视前区；另一个则是下丘脑ARC，ARC 与人类及灵长类动物的漏斗状核是同源核。RP3V 中的Kisspeptin 神经元表现出明显的性别二型性，在雌性中数量较多，并且控制触发排卵的GnRH/LH 分泌高峰[9]。激活第三脑室吻侧室周区的Kisspeptin 神经元对雌激素在下丘脑-垂体-性腺（hypothalamic-pituitary-gonadal, HPG）轴上的正反馈至关重要。在ARC 的KNDy 神经元中，雌激素通过ERα 抑制KISS1 的表达，提示该区域的Kisspeptin神经元可能在调控GnRH 脉冲释放的负反馈中发挥作用[9]。在啮齿动物中，由TAC3 基因编码的NKB 和GnRH 轴突在正中隆起内的解剖位置十分接近。并且在表达GnRH 的神经元上发现受TAC3R 基因编码的NKB 受体（neurokinin 3 receptor, NK3R），提示NKB在调节下丘脑GnRH 释放水平上发挥作用[10]。当编码NKB 及其受体的基因发生突变时，表现为GnRH 释放不足和随后的性腺功能减退，强调NKB 作为生育调节因子的关键性作用[11]。进一步的实验表明TAC3或TACR3基因丧失功能性突变的患者表现为卵巢激素水平下降、青春期发育不足、性腺功能低下[12]。3 种不同的KNDy 肽存在独特的共域化，每种神经肽都与控制GnRH 释放密切相关，在人类生殖神经内分泌网络中发挥重要作用。

HPG 轴在哺乳动物的生殖过程中起决定性作用。位于下丘脑视前区的GnRH 神经元投射到正中隆起，GnRH 神经元以脉冲的方式将GnRH 释放到门静脉系统中，通过刺激垂体前叶促性腺激素细胞合成并分泌黄体生成素和卵泡刺激素调控性腺功能[13]。基于大量的实验，研究者们提出KNDy 神经元是GnRH 脉冲发生器的重要组成部分的假说。KNDy 神经元的假说最初是基于这3 种肽的共域化。这3 种肽对GnRH/LH 的释放具有相反的作用，Kisspeptin 和NKB 是刺激脉冲释放的信号，相反Dynorphin则是终止每个脉冲的信号。在绵羊和大鼠的ARC 中检测到KNDy-KNDy 细胞连接，实验中被标记的一个或多个KNDy 肽的轴突末端与KNDy 阳性细胞体直接接触[14]。KNDy 神经元之间相互连接的存在表明可能产生同步放电，从而刺激和协调GnRH 脉冲释放。此外，小鼠、大鼠和绵羊的大多数KNDy 神经元中存在NK3R 的表达，在绵羊身上进行的免疫荧光实验也显示出90%以上的KNDy 神经元存在dynorphin 的受体（kappa opioid receptor, KOR）[15]，说明KNDy 神经元为KNDy 肽提供合适的受体。并且NKB 和Senktide（NK3R 激动剂）均可以提高KNDy 神经元的动作电位并激发其活性。应用Dynorphin（KOR激动剂）后，小鼠大脑中大多数KNDy 神经元电活动均减少。但是Kisspepetin 对小鼠大脑KNDy 神经元的电活动没有影响[16]，表明Kisspeptin 的作用机制不同于NKB 和Dynorphin。Kisspeptin 可能不直接作用于KNDy 神经元来调节脉冲分泌，是作为一种输出刺激，直接驱动GnRH 神经元的电活动。KNDy 神经元中除了表达Dynorphin 和NKB 的受体外，还表达ERα 和孕酮受体（progesterone receptor, PR），并且在GnRH 神经元中不表达ERα 和PR[14]。因此KNDy 神经元被认为是生殖系统反馈回路的中心节点。

2 绝经后期女性下丘脑KNDy 神经元形态及神经肽基因表达的变化

有研究报道，绝经后期女性的下丘脑神经元呈肥大的状态，显微镜检查显示神经元的大小增加了30%，表现为胞体、胞核、核仁增大及Niss1 物质（粗面内质网）增多[17-18]。肥大的神经元位于人的漏斗核内，这一区域在其他哺乳动物中被称为弓状核（ARC）。进一步的研究发现，位于漏斗核内的肥大神经元表达ERα mRNA、KISS1 mRNA 和NKB mRNA，但是不表达GnRH mRNA，其中绝经后期女性漏斗核内的KISS1和NKB基因表达明显增加。由于绝经后期女性的漏斗核内没有神经细胞的丢失，因此绝经后期女性下丘脑神经元的肥大不是对神经元退化的一种代偿性反应[3]。通过对绝经前后妇女下丘脑内侧连续切片的系统检查发现KISS1 神经元主要位于漏斗核内，漏斗核中表达KISS1 mRNA 的神经元数量显著增加。除漏斗核以外，在下丘脑其他任何区域所标记的KISS1 神经元数量及形态均无变化。在绝经后期的妇女中，表达NKB mRNA 的神经元数量及形态也具有相同的改变[19]。与绝经前女性比较，绝经后期女性漏斗核内的Dynorphin 神经元表现肥大，表达Dynorphin mRNA 的神经元数量明显减少。此种变化导致Dynorphin 合成的总量下降，同时Dynorphin 终止脉冲的作用被降低[17]。年轻猴子的卵巢被切除后，引起漏斗核内KISS1 和NKB神经元肥大。同时KISS1和NKB基因的表达也增加，这种现象与绝经后期妇女的KNDy 神经元的变化十分吻合。当OVX 猴子被给予雌激素或雌激素联合孕酮处理，KISS1和NKB基因的表达被抑制，甚至低于可检测到的水平[20]。表明绝经后期妇女下丘脑KNDy 神经元形态及神经肽基因表达的变化是继发于卵巢雌激素下降。

3 KNDy 神经元在雌激素调节体温和皮肤血管舒张中的作用与机制

3.1 雌激素对核心温度的影响

潮热可由多种刺激引起，包括热刺激、化学刺激、压力或焦虑等其他刺激，其特点是激活散热效应，包括血管扩张、出汗和冷寻求行为[21]。当女性处于寒冷的环境中可以抑制潮热的发生,而当环境温度升高时绝经后期妇女出现潮热的频率会增加[3]。绝经后期出现潮热症状的女性，其核心温度阀值低于未出现症状的女性。在潮热开始前核心温度有轻微的上升，核心温度阀值较低可诱导散热，因此这一微小的变化可能会促使潮热的发生。当潮热触发后，核心温度随之下降[22]。这些研究表明，潮热可能是因控制散热效应器的热调节通路的温度敏感性增加引起的。未经雌激素处理的OVX 大鼠在皮肤血管舒张时的环境温度阀值低于经雌激素处理的OVX 大鼠[3]。因此，在人类和大鼠中雌激素缺乏状态会增加热防御通路的敏感性，导致在较低环境温度下激活散热效应因子。MITTELMAN-SMITH等[23]通过测量大鼠尾部皮肤温度的变化来间接评价潮热，发现大鼠的卵巢切除会增加尾部皮肤血管舒张率。相反的雌激素替代可以降低尾部皮肤血管舒张率，同时可以转变OVX 大鼠的热中性区。此外，环境温度对雌激素调节核心温度（TCORE）有着深远的影响。在较高的环境温度（33℃）下，OVX 大鼠的TCORE 升高，经雌激素处理后可以降低升高的TCORE[23]。在实验中雌激素替代治疗提高在热应激期维持TCORE 的能力。从上述研究中可以看出雌激素对体温调节有明显的作用。在OVX 大鼠模型中，当环境温度为33℃时，14 个被检测的大脑区域中只有在中位视前核（median preoptic nucleus, MnPO）中Fos免疫反应性被显著增强。在24℃的环境温度下雌激素处理大鼠尾部皮肤血管舒张水平降低，同时降低Fos 在MnPO 中的表达。表明MnPO 可能是雌激素影响散热通路的一个位点[24]。

3.2 KNDy 神经元对雌激素调节体温的影响

一项基于规律的血液采集研究表明，LH 脉冲分泌和潮热的产生是同步的，提示潮热与LH 脉冲分泌相吻合[3]。LH 脉冲与潮热的发生有着密切的时序关系，因此推断潮热的触发与控制GnRH 分泌的下丘脑神经回路有关。此外，绝经伴随着下丘脑KNDy 神经元的显著改变，因此MITTELMAN-SMITH 等[23]推测这些神经元可能参与潮热的发生，并且通过向大鼠ARC 内立体定向注射NK3-SPA 来评估KNDy 神经元是否参与温度调节。NK3-SPA 是一种核糖体灭活毒素（Saporin,SAP）与选择性NK3R 激动剂的结合物，NK3-SPA 可以选择性消融ARC 内的KNDy 神经元。OVX 大鼠血清LH 显著升高，当OVX 大鼠被给予雌激素治疗11 d后血清LH 恢复至正常水平。而KNDy 神经元被消融的大鼠在卵巢切除后血清LH 未明显升高，并且无论是否给予雌激素治疗，血清LH 均降低。在光/暗循环的2 个阶段，KNDy 神经元被消融的大鼠皮肤温度和耗热量指标（heat loss index, HLI）明显下降，说明大鼠尾部皮肤血管舒张功能下降。值得注意的是这种效应的发生不受雌激素的影响，表明KNDy 神经元促进皮肤血管舒张。此外，在光期雌激素对大鼠皮肤温度的作用被KNDy 神经元的消融阻断，但是没有影响在暗期雌激素对大鼠皮肤温度的作用[23]。在33℃的环境温度下，对照组大鼠的平均TCORE 显著升高，经雌激素处理后TCORE 明显降低。这个结果与之前的研究一致，展示了雌激素可以提高在高温环境中维持核心温度的能力。而KNDy 神经元消融大鼠的平均TCORE 明显低于对照组大鼠，与对照组不同的是雌激素没有降低KNDy 神经元消融大鼠的平均TCORE，说明KNDy 神经元的消融可以阻断雌激素在热应激期对TCORE 的影响[23]。以上的研究表明KNDy 神经元促进皮肤血管舒张，参与雌激素调节体温[23]。由于皮肤血管舒张是绝经后期潮热的主要特征，这些发现为KNDy 神经元在潮热产生中发挥作用的假说提供强有力的证据。

3.3 KNDy 神经元通过MnPO 中NKB 信号影响皮肤血管舒张

MnPO 是热防御通路的重要组成部分[25]。Fos 在MnPO 中的表达随环境温度的升高而增加，并且受到雌激素的调控，提示MnPO 是一个整合体温调节和生殖功能的位点[24]。在啮齿动物的实验中发现KNDy 神经元投射到对体温调节至关重要的区域，包括MnPO和内侧视前区[21]，这2 个区域均表达NK3R，即NKB的主要受体。NK3R 激动剂被直接微量泵入MnPO 可以增加MnPO 中Fos 的表达并且核心温度也显著降低，与激活散热效应因子的结果一致[26]。该研究结果表明KNDy 神经元可以通过投射到MnPO 中表达NK3R 的神经元调节热防御通路，进而影响皮肤血管舒张。为进一步研究MnPO NK3R 神经元在体温调节中的作用，MITTELMAN-SMITH 等[27]采用立体定向注射NK3-SPA 的方法对这些神经元进行特异性消融，在实验中保留KNDy 神经元。经E2 处理前后，将OVX 大鼠置于3 种环境温度中（11℃、26℃和33℃），分别记录OVX 大鼠的HLI、TSKIN 和TCORE。结果显示，无论是否给予E2 处理，NK3-SAP 组大鼠的HLI 在不同的环境温度下均低于对照组；在11℃和26℃的环境温度下，NK3-SAP 组大鼠的TSKIN 显著降低，表明MnPO NK3R 神经元与KNDy 神经元作用相似，均促进大鼠尾部皮肤血管舒张。在33℃的环境温度下，经E2 处理后NK3-SAP 组和对照组大鼠的TCORE 均降低。此外，在不同环境温度下经E2 处理后，NK3R-SAP 组和对照组大鼠的TSKIN 和HLI 也降低。因此，与KNDy 神经元消融相比，消融MnPO NK3R 神经元不能阻断E2 对TCORE 和TSKIN 的作用，表明MnPO NK3R 神经元对雌激素调节大鼠体温不是必不可少的，但也可能存在代偿机制或者冗余回路[27]。消融MnPO NK3R 神经元后，血清LH 的峰值水平仅轻微降低（约16%），提示表达NK3R 的KNDy 神经元和表达NK3R 的MnPO 神经元在LH 的分泌调控中发挥着不同的作用[27]。此外，对照组大鼠皮下注射Senktide 后诱导TCORE 的快速下降以及MnPO 中Fos 的显著活化，这与直接将Senktide微量泵入MnPO 的结果一致。然而NK3-SPA 组大鼠皮下注射Senktide 后无显著降低大鼠的TCORE，并且在MnPO 中检测到的Fos 细胞数量较少。表明MnPO NK3R 神经元可能介导Senktide 的低温效应[27]。综上所述，MnPO NK3R 神经元消融后，大鼠尾部皮肤血管舒张率持续下降，与消融ARC 内KNDy 神经元后的情况相似。此外，MnPO NK3R 神经元的消融抑制Senktide的低温作用及其对MnPO 的激活作用[27]。本研究支持KNDy神经元通过MnPO 中NKB信号调节热防御通路，进而影响皮肤血管舒张的假说。

在最新的研究中，PADILLA 等[28]将基因和病毒相结合应用于小鼠实验，人工激活下丘脑弓状核中表达Kisspeptin 和NKB 的神经元会导致小鼠皮肤血管舒张（潮热）和相应的核心温度下降，同时诱导MnPO中的Fos 表达。然而这种效应被先前注入到视前区的神经激肽B 受体拮抗剂所阻断。该数据进一步证实KNDy 神经元通过视前区NKB 信号激活散热效应器，进而促进潮热的产生。此外，研究发现KNDy 神经元通过表达NK3R 的谷氨酸能MnPO 神经元亚群间接调节热传导途径[21]。在哺乳动物中KNDy 神经元的许多特征是一致的，MnPO 的形态也是相似的[27]，临床的研究数据显示NKB/NK3R 信号与女性潮热的发生密切相关。给健康的绝经前期女性注射NKB 会引起潮热，这种潮热在位置和持续时间上与绝经后期妇女所表现的潮热症状相似[29]。SASSARINI 和PRAGUE 等[30-31]通过随机、双盲、安慰剂对照试验研究口服NK3R 拮抗剂（MLE4901）作为一种治疗绝经后期潮热的新疗法。受试者在使用MLE4901 期间潮热的严重程度和频率均显著降低，并且未产生严重的不良反应，其中仅有3 例受试者的谷丙转氨酶轻微升高，并且在90 d 内恢复正常。此外，进一步的研究发现口服NK3R 拮抗剂可以快速减少血管舒缩症状的发生频率和严重程度，参与者的睡眠也有明显改善[32]。另外一项遗传学研究结果提供进一步的证据，在近1.8 万女性的全基因组相关联研究中发现，潮热的发生与编码NK3R的TACR3基因的14 个单核苷酸多态性有关。因此，TACR3 基因的遗传多态性可以帮助解释女性潮热的不同表现[33-34]。本研究表明，NKB/NK3R 信号是绝经后期潮热的重要中介，口服拮抗剂NK3R 可能成为一种新的靶点。以上研究表明，NKB/NK3R 信号是绝经后期潮热的重要中介，并且可能成为一种新的治疗靶点。

4 结语

潮热发生在大多数绝经后期妇女中，严重影响妇女的生活质量，对副作用小的新型治疗方案的需求已成为近年来的研究热点。KNDy 神经元在血管舒缩症状中的作用受到人们的关注。对大鼠ARC 内的KNDy神经元进行消融可以减少尾部皮肤血管舒张，进而降低大鼠尾部皮肤温度。此外，KNDy 神经元的消融部分阻断雌激素调节体温的作用，表明KNDy 神经元可能在雌激素介导的体温调节中发挥作用。KNDy 神经元投射到表达NK3R 的MnPO，通过消融MnPO NK3R神经元可以削弱senktide 降低体温和激活MnPO 的作用。研究结果为KNDy 神经元参与潮热产生的假说提供有力的证据，KNDy 神经元的调节可能成为治疗潮热的新方法。其中KISS1 与NKB 有望作为一种治疗VMS 的新靶点。随着KNDy 神经元研究的深入，将会为绝经后期女性血管舒缩症状提供新的疗法，推动临床诊断和治疗的进步。