氨基酮戊酸光动力对痤疮丙酸杆菌生物膜的作用

刘宇甄，曾 荣，段志敏，徐浩翔，吴秋菊，陈 青，林 彤，李 岷

1中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所激光科，南京210042 2江苏省血液中心，南京210042 3中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所江苏省皮肤性病学分子生物学重点实验室，南京 210042

痤疮丙酸杆菌在痤疮发病机制中占有重要地位。Jahns等[1]研究发现，37%的寻常痤疮患者皮脂腺中存在痤疮丙酸杆菌生物膜。痤疮丙酸杆菌生物膜形成后[2-3]，不仅对宿主的致病性增加，对抗菌药物的耐药能力也显著增强[4-6]。氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid，ALA)-光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)已广泛应用于中重度痤疮的临床治疗，并取得较好疗效，但其具体治疗机制目前尚不完全清楚。本研究在体外构建了痤疮丙酸杆菌生物膜模型，观察了ALA-PDT对痤疮丙酸杆菌生物膜的影响。

材料和方法

菌株、主要试剂及仪器痤疮丙酸杆菌(ATCC 11827)(美国ATCC公司)，脑心浸液培养基(brain heat infusion，BHI)(美国 Oxiod公司)，ALA(上海复旦张江生物制药有限公司)，live/DeadTMbacklightTMbacterial viability kit(美国，Thermo Fisher Scientific公司)，四甲基氮盐[2，3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT](美国Sigma公司)；激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM)(OLYMPUS-FV1000，日本奥林巴斯株式会社公司)，半导体激光器(LED，武汉亚格光电技术有限公司)，酶标仪、恒温培养箱(美国Thermo公司)，厌氧培养装置(美国STEMCELL Technologies公司)。

ALA溶液配制采用生理盐水配制，配制浓度为200 mmol/L，0.22 μm过滤器滤除菌后避光保存，现配现用。

生物膜体外构建参考Coenye等[4]的生物膜构建法，构建24孔板和96孔板两种规格的生物膜，24孔板生物膜主要用于后续的CLSM观察研究，96孔板生物膜主要用于后续的XTT法活力测定研究。24孔板生物膜构建过程：制备浓度为1×108CFUs/ml BHI培养基菌悬液，取1 ml置于24孔细胞培养板孔中，在该24孔细胞培养板中提前放置无菌细胞爬片，然后在厌氧培养装置中持续孵育，温度设置为37℃；每2 d换新鲜BHI液体培养基1次，持续孵育8 d构建成熟痤疮丙酸杆菌生物膜。96孔板生物膜构建过程：基本同24孔板，仅在菌悬液体积和有无细胞爬片方面有调整，即96孔板孔中直接加入0.1 ml浓度为1×108CFUs/ml BHI培养基菌悬液，无需提前放置细胞爬片。

ALA-PDT处理及分组分为以下6组：(1)阴性对照组(ALA-PDT-组)：生物膜不用ALA或LED光照处理；(2)单纯ALA药物作用组(ALA组)；(3)单纯LED光照作用组(LED组)(光照剂量100 J/cm2)；(4)ALA-PDT1组：ALA浓度50 mmol/L+LED光照剂量50 J/cm2；(5)ALA-PDT2组：ALA浓度50 mmol/L+LED光照剂量100J/cm2；(6)ALA-PDT3组：ALA浓度50 mmol/L+LED光照剂量200 J/cm2。

ALA-PDT处理体外构建成熟生物膜的步骤为：250 μl 50 mmol/L ALA溶液置于24孔板构建的成熟生物膜中，40 μl 50 mmol/L ALA溶液置于96孔板构建的成熟生物膜中；37℃厌氧环境培养30 min后，采用LED光源进行不同光照剂量处理，光动力详细步骤参照文献[7]。50、100、200 J/cm23个光照剂量组分别使用功率为25、50、100 mW/cm2的LED光照处理，所有分组使用对应的光照功率均接受照射33 min。使用1×PBS清洗生物膜表面3遍，再通过CLSM观察法或XTT检测法研究不同分组生物膜结构、生物膜活力差异。

CLSM观察生物膜的结构及死菌/活菌比值通过CLSM观察不同光照剂量作用下ALA光动力效应差异。采用染料LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial Viability Kit对痤疮丙酸杆菌生物膜进行染色观察，该染料含有SYTO9和PI两种荧光染料，前者可在480 nm激光作用下使活菌显示绿色荧光，后者可以在635 nm激光作用下使死菌显示红色荧光。按照试剂说明书在实验前临时配制染液进行染色观察研究。将SYTO9/PI混合液中SYTO9和PI浓度均调整至1.67mmol/L。24孔板生物膜经过ALA-PDT预处理后，从细胞培养板中取出细胞爬片；使用1×PBS清洗生物膜表面，反复3次；在生物膜表面加入200 μl上述染料混合液，置于厌氧培养装置中37℃孵育30 min；使用CLSM进行观察。通过显微镜自带的荧光比值计算软件计算红色荧光与绿色荧光的比值。还可使用CLSM附带软件(Olympus fluo view 3.1 viewer)对生物膜进行三维立体结构重建。

XTT法活力测定按照说明书配制XTT(0.5 mg/ml)/维生素K3(Vit K3：10 mmol/L)混合液，现配现用，用于测定生物膜活体部分的代谢活力，以此评价生物膜的活力、生物膜的生长情况及抑制效应。96孔板生物膜经过ALA-PDT预处理后，先吸弃悬浮液，再使用1×PBS清洗96孔培养板中生物膜3遍。然后每孔加入100 μl XTT/Vit.K3混合液。铝箔纸包扎避光，厌氧培养装置中37℃培养3 h。然后吸取上述孔中50 μl上清至酶标仪板中使用490 nm波长光源测定分光光度值。

统计学处理采用 SPSS 16.0统计软件，所有实验至少重复3次以上，实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

ALA-PDT处理对痤疮丙酸杆菌生物膜结构的影响痤疮丙酸杆菌孵育8d后，在细胞爬片表面可见灰白色膜状物。经SYTO9/PI荧光染色剂染色后，置于CLSM下进行观察，可见生物膜呈现犹如草坪样的绿色三维立体结构，其内有大致均匀分布的孔道；与ALA-PDT-组相比，ALA-PDT1组、ALA-PDT2组和ALA-PDT3组的生物膜结构明显被破坏，且光照强度越强，生物膜结构破坏越严重(图1)。

不同ALA-PDT处理对痤疮丙酸杆菌生物膜死菌/活菌比值的影响ALA-PDT-组、ALA组、LED组、ALA-PDT1组、ALA-PDT2组和ALA-PDT3组的痤疮丙酸杆菌生物膜死菌/活菌比值分别为0.350±0.033、0.305±0.046、0.330±0.032、1.525±0.439、2.293±0.148和3.092±0.189，差异有统计学意义(F=199.312，P<0.001)；其中，ALA组(md=0.003，P=1.000)和LED组(md=-0.025，P=1.000)与ALA-PDT-组差异无统计学意义；ALA-PDT1组(md=-0.162，P<0.001)、ALA-PDT2组(md=-0.254，P<0.001)和ALA-PDT3组(md=-0.352，P<0.001)明显高于ALA-PDT-组；ALA-PDT1组、ALA-PDT2组和ALA-PDT3组间两两相比差异也均有统计学意义(P均<0.001)。

ALA：氨基酮戊酸；PDT：光动力疗法
ALA：5-aminolevulinic acid；PDT：photodynamic therapy
图1利用共聚焦激光扫描显微镜观察痤疮丙酸杆菌生物膜在不同光照剂量下(50、100、200 J/cm2)的生物膜抑制情况，并使用该显微镜自带三维重建软件对生物膜进行三维重建(×400)
Fig1Biofilm inhibition ofP.acnesbiofilms at different ALA-PDT light doses (50，100，200 J/cm2) under confocal laser scanning microscope，the biofilm was reconstructed in three dimensions using the microscope with 3D reconstruction software (×400)

不同ALA-PDT处理对痤疮丙酸杆菌生物膜活力的影响ALA-PDT-组、ALA组、LED组、ALA-PDT1组、ALA-PDT2组和ALA-PDT3组的痤疮丙酸杆菌生物膜活力分别为0.462±0.028、0.465±0.044、0.437±0.047、0.301±0.040、0.207±0.001和0.110±0.007，差异有统计学意义(F=158.537，P<0.001)；其中，ALA组(md=-0.044，P=1.000)和LED组(md=-0.020，P=1.000)与ALA-PDT-组相比差异没有统计学意义；ALA-PDT1(md=1.175，P<0.001)、ALA-PDT2(md=1.942，P<0.001)和ALA-PDT3组(md=2.742，P<0.001)明显低于ALA-PDT-组；ALA-PDT1组、ALA-PDT2组和ALA-PDT3组间两两相比差异也均有统计学意义(P均<0.001)。

讨 论

研究显示，90%的青少年几乎都出现过不同程度的痤疮[8]。痤疮皮损不仅短期影响患者的容貌，而且部分皮损消退后会残留永久性瘢痕。近年来，ALA-PDT法在中重度痤疮中得到了较为广泛的应用。相对于常规药物治疗，其优势在于起效时间快且疗效显著[9-10]。然而其对痤疮的作用机制尚不完全清楚。既往有研究探索了ALA-PDT对金黄色葡萄球菌生物膜[11]、白念珠菌生物膜[12]有一定的抑制作用，尚未见ALA-PDT对痤疮丙酸杆菌生物膜的相关研究报道。本研究观察了ALA-PDT对痤疮丙酸杆菌生物膜的作用效应。

首先，本研究成功构建了痤疮丙酸杆菌生物膜的体外模型，采用CLSM观察其结构，可见该生物膜呈现三维立体空间结构，其内不仅有相互黏连的细菌细胞，同时结构内部还可见大致均匀分布的孔道，与其他细菌及真菌成熟生物膜中见到的孔道结构类似[13-15]，推测可能是生物膜输送营养的通道。进一步给予50、100、200 J/cm2LED光照强度的照射，结果发现，随着光照强度的增加，痤疮丙酸杆菌生物膜受到抑制，且光照强度越高，生物膜结构破坏越显著，出现破损、空洞状情况越显著。与Liu等[16]采用ALA-PDT作用于铜绿假单胞菌生物膜的体外研究结果相似。对生物膜的死菌/活菌比值检测结果显示，经过ALA-PDT作用后，死菌比值显著升高，活菌比值显著下降；且光照强度越高，死菌比值越高。与李欣等[17]对ALA-PDT作用于表皮葡萄球菌生物膜研究结果类似。表明不论是需氧型细菌还是厌氧型细菌，在经历ALA-PDT作用后，死菌/活菌比值都会随着光照剂量的增加而增加。该现象在XTT测定生物膜活力的实验中也得到进一步证实。

目前ALA-PDT法对微生物的杀伤机制还不清楚，其大致原理是对靶目标进行光敏氧化。基本过程分两步：第1步：光敏剂被微生物等靶目标吸收；第2步：合适波长光照激发光敏剂，产生自由基和单线态氧，进而对微生物产生毒性，从而达到灭活细菌的效果[18]。基于上述理论，我们推测ALA-PDT对痤疮丙酸杆菌生物膜结构产生破坏作用可能源于ALA渗透入生物膜细菌菌体后，进行光照作用，产生自由基和单线态氧，导致菌体破坏，进而出现生物膜结构破坏。

综上，本研究体外成功构建了痤疮丙酸杆菌生物膜，并对其ALA-PDT作用后效应观察，结果显示ALA-PDT法能够较好地破坏痤疮丙酸杆菌生物膜的结构，并抑制生物膜的活力。该效应在临床治疗中对生物膜的影响情况需要更多的动物实验及临床试验进行探索。