小花清风藤中黄酮类成分的研究

潘国吉孙庆文徐文芬柏彩红刘梦鸽陆 祥张 叶

（贵州中医药大学，贵州 贵阳550025）

小花清风藤Sabia parvifloraWall.ex.Roxb.属于清风藤科清风藤属植物，为贵州省2003 年版《中药材、民族药材质量标准》 收载品种。国内主要分布于贵州西南部、云南东南部至西南部、广西西部及西南部［1］。在贵州西南地区，苗族、布依族用小花清风藤的茎藤治疗风湿关节痛、跌打损伤痛、肝炎等［2-3］。通过查阅整理相关的文献资料可知，小花清风藤中主要含有五环三萜类［4-7］、生物碱类［8-10］、黄酮类［11-12］和挥发油类［13］等。其中黄酮类化合物具有抗衰老、抗肿瘤、降低血糖、抗炎及抑菌抗病毒等药理作用，极有可能是该药材发挥药效作用的成分类群之一。而小花清风藤药材现报道的黄酮类成分仅有芦丁、槲皮素、芹菜素、山柰酚、木犀草素等，因大多数药材均含有以上几种黄酮类成分，选择其作为该药材质量控制指标缺乏专属性，难于客观评价药材的优劣。鉴于此，本研究结合多种色谱分离技术，进一步挖掘小花清风藤药材中黄酮类成分，以期发现结构新颖且具有生物活性的黄酮类化合物，为建立该药材多指标质量控制方法及其药效物质基础研究提供依据。

1 材料

WNMR-Ⅰ600 MHz 核磁共振波谱仪（中国科学院武汉物理与数学研究所）；超高压液相色谱三重四级杆串联质谱仪（美国Waters 公司）；Therom Ultimate -3000 型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher 公司）；分析和半制备型高效液相色谱仪为Agilent 1100 型（美国Agilent 公司）；RE-5210 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化有限公司）；BuchiR-215 型旋转蒸发仪（瑞士Buchi 公司）；AG135 电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）。

实验药材于2017 年6 月采自贵州省镇宁县，原植物经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为清风藤科清风藤属植物小花清风藤Sabia parvifloraWall.ex.Roxb.，植物凭证标本（P-201708001）保存于贵州中医药大学生药实验室。

2 提取与分离

将自然干燥的小花清风藤茎和叶（11.22 kg），经粉碎机粉碎，得粗粉（10.8 kg），用甲醇回流提取3 次（2 h ／次），合并滤液，减压浓缩至无醇味，加水溶解，上样于D-101 大孔树脂，依次用25%、70%、100%甲醇溶液洗脱，浓缩，干燥，得浸膏（25% 甲醇洗脱部位0.75 kg、70% 甲醇洗脱部位1.67 kg 和100% 甲醇洗脱部位1.17 kg）。取适量70%甲醇洗脱部位浸膏经硅胶色谱柱分离，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得2 个组分Fr.1-1～1-2。Fr.1-1 过硅胶色谱柱，经二氯甲烷-甲醇（20∶1～4）洗脱，再经制备HPLC 甲醇-水（60∶40）得化合物5（46 mg）、6（62 mg）、7（41 mg）；Fr.1-2 经ODSA-HG 反相色谱柱，甲醇-水（3∶7）洗脱，得组分Fr.1-2-1 和Fr.1-2-2。Fr.1-2-1 经制备HPLC 甲醇-水（60∶40）洗脱，得化合物3（137 mg）、4（89 mg），Fr.1-2-2 经制备HPLC 甲醇-水（50∶50）洗脱，得化合物1（59 mg）、2（153 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：黄色粉末，盐酸镁粉反应阳性，Molish 反应阳性；ESI-MSm／z：649.4 ［M＋Na］＋、625.3［M-H］-，UV λmax 为256 nm（带Ⅱ），355 nm（带Ⅰ）。相对分子量626，分子式C27H30O17。1HNMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.57（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2′），7.56（1H，dd，J＝8.8，2.0 Hz，H-6′），6.84（1H，d，J＝8.8 Hz，H-5′），6.37（1H，d，J＝2.1 Hz，H-8），6.17（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），5.40（1H，d，J＝7.2 Hz，Glu H-1），4.06（1H，d，J＝7.8 Hz，Glu H-1）；13C-NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ：156.4（C-2），133.3（C-3），177.3（C-4），161.2（C-5），98.8（C-6），164.5（C-7），93.7（C-8），156.3（C-9），104.0（C-10），121.1（C-1′），115.3（C-2′），144.8（C-3′），148.6（C-4′），116.2（C-5′），121.7（C-6′），100.9（Glu C-1），73.4（Glu C-2），76.5（Glu C-3），69.8（Glu C-4），76.4（Glu C-5），68.1（Glu C-6），103.1（Glu C-1），74.0（Glu C-2），76.5（Glu C-3），69.7（Glu C-4），76.4（Glu C-5），60.7（Glu 5-CH3）。以上数据与文献［14-15］基本一致，故鉴定为槲皮素-3-O-龙胆双糖苷。

化合物2：黄色粉末，盐酸镁粉反应阳性，Molish 反应阳性；ESI-MSm／z：765.1 ［M＋Na］＋、741.3 ［M-H］-，UV λmax 为256 nm（带Ⅱ），355 nm（带Ⅰ）；相对分子量742，分子式C32H38O20。1HNMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：7.70（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2′），6.87（1H，d，J＝8.5 Hz，H-5′），7.62（1H，dd，J＝12.0，2 Hz，H-6′），6.36（1H，d，J＝2.0 Hz，H-8），6.18（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），4.55（1H，d，J＝1.0 Hz，Rha H-1），4.38（1H，d，J＝7.5 Hz，Xyl H-1），1.13（3H，d，J＝5.9 Hz，Rha 5-CH3）；13C-NMR（151 MHz，Methanol-d4）δ：159.2（C-2），135.5（C-3），179.1（C-4），162.7（C-5），100.3（C-6），166.6（C-7），95.2（C-8），158.5（C-9），105.3（C-10），123.1（C-1′），117.8（C-2′），145.7（C-3′），149.7（C-4′），116.1（C-5′），123.5（C-6′），104.7（Glu C-1），75.7（Glu C-2），78.1（Glu C-3），71.6（Glu C-4），77.1（Glu C-5），68.9（Glu C-6），102.3（Rha C-1），71.5（Rha C-2），82.4（Rha C-3），72.7（Rha C-4），69.4（Rha C-5），17.9（Rha 5-CH3），106.4（Xyl C-1），75.2（Xyl C-2），77.5（Xyl C-3），71.0（Xyl C-4），66.8（Xyl C-5）。以上数据与文献［16］基本一致，故鉴定为camellianoside。

化合物3：黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应阳性；ESI-MSm／z：632.9 ［M＋Na］＋、609.4 ［M-H］-，UV λmax 为256 nm（带Ⅱ），355 nm（带Ⅰ）；相对分子量610，分子式C27H30O16。1HNMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：7.62（1H，d，J＝8.5 Hz，H-6′），6.87（1H，d，J＝8.5 Hz，H-5′），6.35（1H，s，H-8），6.17（1H，s，H-6），5.11（1H，d，J＝7.4 Hz，Glu H-1），4.55（1H，Rha H-1），1.14（3H，d，J＝6.3 Hz，Rha 5-CH3）；13C-NMR（151 MHz，Methanol-d4）δ：158.3（C-2），135.6（C-3），179.2（C-4），162.7（C-5），99.9（C-6），165.8（C-7），94.9（C-8），159.2（C-9），105.5（C-10），123.6（C-1′），117.7（C-2′），145.6（C-3′），149.7（C-4′），116.0（C-5′），123.1（C-6′），104.7（Glu C-1），73.9（Glu C-2），78.1（Glu C-3），69.6（Glu C-4），77.1（Glu C-5），68.5（Glu C-6），102.3（Rha C-1），72.2（Rha C-2），72.0（Rha C-3），75.7（Rha C-4），71.3（Rha C-5），17.9（Rha 5-CH3）。以上数据与文献［17］基本一致，故鉴定为芦丁。

化合物4：棕色结晶，盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应阳性；ESI-MSm／z：749.1 ［M＋Na］＋、725.2 ［M-H］-，UV λmax 为265 nm（带Ⅱ），346 nm（带Ⅰ）；相对分子量726，分子式C32H38O19。1HNMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：8.07（1H，s，H-6′），8.04（1H，s，H-2′），6.89（1H，d，J＝2.0 Hz，H-3′），6.89（1H，d，J＝2.0 Hz，H-5′），6.37（1H，d，J＝2.0 Hz，H-8），6.19（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），5.11（1H，d，J＝7.1 Hz，Glu H-1），4.52（1H，d，J＝1.6 Hz，Rha H-1），4.34（1H，d，J＝7.4 Hz，Xyl H-1），1.11（3H，d，J＝6.0 Hz，Rha 5-CH3）；13C-NMR（151 MHz，Methanol-d4）δ：159.4（C-2），135.4（C-3），179.2（C-4），162.9（C-5），100.1（C-6），166.1（C-7），95.1（C-8），158.5（C-9），105.6（C-10），122.7（C-1′），132.4（C-2′），116.1（C-3′），161.4（C-4′），116.1（C-5′），132.4（C-6′），104.5（Glu C-1），75.7（Glu C-2），78.1（Glu C-3），71.7（Glu C-4），77.1（Glu C-5），69.0（Glu C-6），102.2（Rha C-1），71.7（Rha C-2），82.4（Rha C-3），72.7（Rha C-4），69.5（Rha C-5），17.9（Rha 5-CH3），106.3（Xyl C-1），75.3（Xyl C-2），77.5（Xyl C-3），71.0（Xyl C-4），66.8（Xyl C-5）。以上数据与文献［18］基本一致，故鉴定为tsubakioside A。

化合物5：黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应阳性；ESI-MSm／z：616.8 ［M＋Na］＋、592.7 ［M-H］-，UV λmax 为265 nm（带Ⅱ），346 nm（带Ⅰ）；相对分子量594，分子式C27H30O15。1HNMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.56（1H，s，5-OH）10，10.85（1H，s，7-OH），10.13（1H，s，4′-OH），7.98（1H，m，H-2′，6′），6.88（1H，m，H-3′，5′），6.88（1H，d，J＝8.9 Hz，），6.41（1H，d，J＝2.1 Hz，H-8），6.20（1H，d，J＝2.1 Hz，H-6），5.31（1H，d，J＝7.6 Hz，Glu H-1），4.，37（1H，d，J＝1.5 Hz，Rha H-1），0.98（3H，d，J＝6.2 Hz，Rha 5-CH3）；13C-NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ：156.9（C-2），133.3（C-3），177.4（C-4），161.2（C-5），98.8（C-6），164.1（C-7），93.8（C-8），156.5（C-9），104.0（C-10），120.9（C-1′），130.9（C-2′），115.1（C-3′），159.9（C-4′），115.1（C-5′），130.9（C-6′），101.4（Glu C-1），74.2（Glu C-2），75.8（Glu C-3），71.8（Glu C-4），76.4（Glu C-5），66.9（Glu C-6），100.8（Rha C-1），70.6（Rha C-2），70.4（Rha C-3），71.8（Rha C-4），68.3（Rha C-5），17.8（Rha 5-CH3）。以上数据与文献［19］基本一致，故鉴定为山柰酚-3-O-芸香糖苷。

化合物6：黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应阳性；ESI-MSm／z：647.4 ［M＋Na］＋、623.0 ［M-H］-，UV λmax 为257 nm（带Ⅱ），357 nm（带Ⅰ）；相对分子量624，分子式C28H32O16。1HNMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.57（1H，d，J＝2.4 Hz，H-2′），6.85（1H，d，J＝8.1 Hz，H-5′），6.66（1H，d，J＝2.3 Hz，H-8），6.35（1H，d，J＝2.3 Hz，H-6），5.35（1H，d，J＝7.1 Hz，Glu H-1），4.37（1H，d，J＝1.2 Hz，Rha H-1），3.85（3H，s，3′-OCH3），0.97（3H，d，J＝6.2 Hz，Rha 5-CH3）；13C-NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ：157.0（C-2），133.6（C-3），177.6（C-4），160.9（C-5），98.0（C-6），165.2（C-7），92.3（C-8），156.5（C-9），105.1（C-10），121.2（C-1′），115.3（C-2′），144.9（C-3′），148.6（C-4′），116.5（C-5′），121.8（C-6′），101.2（Glu C-1），74.1（Glu C-2），76.1（Glu C-3），70.2（Glu C-4），76.5（Glu C-5），67.1（Glu C-6），100.8（Rha C-1），70.5（Rha C-2），70.7（Rha C-3），71.9（Rha C-4），68.3（Rha C-5），17.83（Rha 5-CH3）。以上数据与文献［20］基本一致，故鉴定为异鼠李素-3-O-芸香糖苷。

化合物7：黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应阳性；ESI-MSm／z：309.2 ［M＋Na］＋、285.1 ［M-H］-，UV λmax 为266 nm（带Ⅱ），366 nm（带Ⅰ）；相对分子量286，分子式C15H10O6。1HNMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：8.06（2H，dd，J＝3.6，9.9 Hz，H-2′，H-6′），6.89（2H，dd，J＝3.6，9.9 Hz，H-3′，H-5′），6.42（1H，d，J＝2.1 Hz，H-8），6.18（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6）；13C-NMR（151 MHz，Methanol-d4）δ：147.0（C-2），137.1（C-3），177.3（C-4），160.5（C-5），99.2（C-6），163.8（C-7），93.4（C-8），156.2（C-9），103.2（C-10），121.7（C-1′），130.0（C-2′），116.3（C-3′），169.5（C-4′），116.3（C-5′），130.0（C-6′）。以上数据与文献［21］基本一致，故鉴定为山柰酚。

4 讨论

通过多种色谱和光谱技术相结合，从小花清风藤中分离得到7 个黄酮类化合物，其中有5 个化合物（1～2、4～6）为首次从该植物中分离得到。研究结果丰富了小花清风藤药材的化学成分，以期为完善2003 年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》收载品种小花清风藤药材的质量标准及其药效物质基础的研究奠定基础，同时为小花清风藤药材综合开发利用提供依据。