新型冠状病毒肺炎确诊病例粪便标本的病毒核酸检测

吴冰珊，俞婷婷，黄枝妙，陈宏彬，陈 炜，张炎华，游丽斌，朱 颖，吴晶晶，鄢育青，翁育伟

2020年2月11日，世界卫生组织将新型冠状病毒感染引起的肺炎命名为“COVID-19”。由于人员流动，福建省各地市也相继发现了输入性确诊病例。目前认为本病的传染源主要是COVID-19患者，经呼吸道飞沫传播是主要的传播途径。Holshue等首次报道在确诊病例的上呼吸道和粪便中检出2019-nCoV[1]，对于2019-nCoV是否通过粪便污染水、食物和环境直接或间接接触造成人传人感染，需要进一步科学验证。笔者对36例确诊病例的粪便标本/肛拭子标本进行病原体检测，初步探讨2019-nCoV经消化道感染的可能性。

1 材料与方法

1.1标本来源 本中心在厦门、宁德、三明、福州、南平、莆田、漳州等地共采集36例COVID-19确诊病例标本，包括31份粪便标本和5份肛拭子标本。为维持病毒的最佳存活条件，送检标本被分装于若干管，取其中一管以生理盐水处理成10%悬液，高速离心(8 000 r/min，5 min)后取悬液进行检测，其余-20 ℃冻存以待进一步分析。

1.2病毒RNA提取 参照病毒DNA/RNA提取试剂盒(天隆,西安)说明书进行操作，吸取离心后的标本悬液上清200 μL，加入到预混的深孔板，于生物安全柜静置10 min后，置全自动病毒核酸提取仪NP968-S(天隆,西安)提取病毒核酸。程序运行结束后，吸取核酸转置于1.5 mL离心管，直接用于实时荧光RT-PCR或-20 ℃冷冻。

1.3基因片段扩增 根据中国CDC推荐的引物和探针扩增2019-nCoV病毒的ORF1ab和核壳蛋白N基因[2]，使用AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit(AB, AM1005)在ABI7500荧光检测仪进行检测，逆转录条件包括45 ℃ 10 min及95 ℃ 10 min灭活；PCR扩增条件为40个扩增循环，包括95 ℃15 s和60 ℃ 60 s收集荧光，检测通道Ct值<37判断为阳性。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据处理，采用Fisher’s确切概率法进行率的比较，P<0.05表示有统计学意义。

2 结 果

2.1检测概况 36例COVID-19确诊病例中有 20 例的标本检出 2019-nCoV，阳性率为 55.56%，其中包括男性22例、女性14例，检出率分别为54.55%(12/22)和57.14%(8/14)。病例年龄分布于17～86岁之间，平均为48.75岁。性别和年龄组间阳性检出率均无统计学差异(P=1.00)。

2.2不同临床分型病例的检测结果 根据36例患者临床表现的轻重不同进行临床分型，其中危重症病例和重症病例标本阳性率均为 66.67%(2/3、6/9)、普通肺炎病例阳性率为62.50%(10/16)、轻症肺炎病例阳性率为25.00%(2/8),各临床类型组间病毒检出率无统计学差异(P=0.303)。根据病例来源，36例患者分为散发病例和聚集性病例，两种病例来源的2019-nCoV检出率分别为42.86%(6/14)和63.64%(14/22)，二者之间无统计学差异(P=0.307)。

2.3采样时间和核酸载量分布 36例患者标本采样时间与发病时间间隔天数平均为9.89 d。20例粪便标本检出 2019-nCoV 核酸的阳性患者，从发病到采样的中位时间为9 d(3～17 d),16 例未检出 2019-nCoV 核酸的患者从发病到采样的中位时间为 10 d(5～16 d)，两者无明显差异。2019-nCoV核酸阳性标本的核酸载量有较大范围分布，2019-nCoV ORF1ab基因 Ct 值从22至 29之间的标本为7例(7/20,占35%)，Ct 值大于30的为13例(13/20,占 65%)； 2019-nCoV N基因Ct 值从 21至30之间的标本为6例(6/20,占30%)，Ct值大于30的为14例(14/20,占 20%)。标本采样时间和核酸载量没有明显相关性。

2.4标本类型 36份标本来自于36个COVID-19确诊病例，其中4例临床上有腹泻症状，包括5份肛拭子标本和31份粪便标本，分别检出阳性标本2份(2/5，40%)和18份(18/31，58.06%)，阳性检出率无统计学差异(P=0.637)。

3 讨 论

2019-nCoV被确定为引起2019年中国COVID-19暴发的病原体，并成为国际关注的突发公共卫生事件[3]。病毒全基因组序列信息分析提示2019-nCoV序列之间高度相似(>99%)，与SARS病毒、MERS病毒进化上同属于β-冠状病毒属，但基因特征与SARS病毒和MERS病毒有明显区别，与来自云南的中华菊头蝠的冠状病毒(Gisaid EPI_ISL_402131)最接近，高达96.2%的相似性，因此多数学者认为证实了2019-nCoV病毒应源于动物源性的观点[4-6]。一般认为冠状病毒通过感染作为中间宿主的野生动物，并可能通过基因重组和突变扩大遗传多样性及增强对人类致病能力[7]，然而，2019-nCoV如何突破物种界限引起人类感染，需通过进一步深入研究加以阐明。

现有临床资料提示2019-nCoV致病性虽然低于SARS和MERS病毒，但仍能导致严重的呼吸系统疾病，甚至引起死亡病例，家庭聚集病例和医务工作者出现感染的报告明确指出2019-nCoV具有人际传播能力[8-9]。目前资料表明2019-nCoV传播途径主要是呼吸道飞沫传播和接触传播，气溶胶和消化道传播途径尚未明确，具体传播能力和方式仍然存在争议，因此对提供有效的控制措施存在不确定性。既往研究认为冠状病毒能存在于雪貂等动物粪便但不引起动物发病[10]，推测新发2019-nCoV类似于其他感染人的冠状病毒可能首先在人呼吸道和肠道的上皮细胞进行感染复制，进而导致细胞病变[11]，但2019-nCoV致病机制的分子基础尚需进行深入的研究得以阐明。我们的结果初步表明55.56%的确诊患者可排出2019-nCoV，证实COVID-19确诊患者同SARS病人一样除了以呼吸道、密切接触患者呼吸道分泌物传播外，也可能通过潜在的粪-口途径传播，包括粪便标本污染的手、食物、水等，通过侵入口腔、呼吸道粘膜和眼结膜等侵入方式导致感染。CHEN等认为COVID-19患者与SRAS感染者不同，肠道症状如腹泻比例较低[12]，但鉴于2019-nCoV和SARS-CoV高度相似，推测2019-nCoV也有可能造成病毒血症和影响呼吸道以外的组织器官。本研究确诊病例中具有腹泻症状者仅占11.11%，粪便和肛拭子标本的2019-nCoV病毒检出率无统计学差异，临床上可仅检测其中一种标本，以减少检测工作量。

本研究提示COVID-19确诊病例肠道标本的2019-nCoV阳性检出率在临床分型、性别、年龄和标本类型等各变量组间均无统计学差异，标本采样时间和病毒核酸载量没有明显相关性。由于仅局限于36例确诊病例，样本量较小，需要扩大样本量进一步观察。同时由于没有在同一患者同时采集粪便和肛拭子标本及发病时间多次采样，影响病毒阳性检出率的比较。人体胃酸通常对包膜病毒有杀灭作用，暂还不能确定2019-nCoV是否能通过粪口途径由胃进入肠道导致感染引起暴发传播。鉴于2019-nCoV疫情目前的资料较少，需要继续开展对COVID-19病例粪便排毒和呼吸道排毒的监测，动态跟踪研究当患者呼吸道标本病毒核酸阴性时，比对粪便标本是否停止排毒，进一步评估了解病毒和传播的特征，以完善风险评估和采取控制措施遏制病毒的传播。