微波结合真菌发酵液辅助水蒸气蒸馏法提取马来沉香挥发油的工艺优化

陈兴静，杨思惠，吴胜鸿，黄圆圆，章卫民，陈晓颖，高晓霞

(1.广东药科大学药学院，广东 广州 510006； 2.广东省微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室/广东省菌种保藏与应用重点实验室/广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州 510070)

沉香是名贵的药材和天然香料，为瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属(Aquilaria)植物含有树脂的木材[1]。目前发现的沉香属21种植物中，主要用于产香的是A.sinensis(Lour.) Gilg.、A.malaccensisLamk.(syn.A.agallochaRoxb.[2])、A.subintegraDing Hou、A.crassnaPierre等[3-4]，由A.malaccensis产生的沉香称之为马来沉香。沉香的主要有效成分是沉香挥发油，以倍半萜和芳香族化合物为主[5]，其中倍半萜类化合物主要包括愈创木醇、沉香螺醇、γ-桉叶油醇等，芳香族化合物主要包括苄基丙酮、茴香基丙酮等[6-9]。

沉香挥发油提取方法主要有水蒸气蒸馏[10]、溶剂提取[11]和CO2超临界流体萃取[12]等方法。水蒸气蒸馏提取的挥发油品质好，但耗时长、提取率低；溶剂提取所得的挥发油含2-(2-苯乙基)-色酮类等较高沸点的成分较多，得油率较高，但易残留有机溶剂，油品质稍差；CO2超临界流体萃取无溶剂残留，但成本昂贵，且含油蜡质等杂质，需再次精制[13]。为提高沉香挥发油提取率，已有报道采用微波辅助[14]、酶辅助[15]及内生真菌发酵[16]辅助溶剂法提取，还有学者采用酶结合微波辅助溶剂法提取[17]。关于水蒸气蒸馏法提取沉香挥发油的辅助方法，本课题组前期通过微波、酶解、内生真菌发酵液浸泡等辅助方法对水蒸气蒸馏法提取马来沉香挥发油化学组成的影响进行了研究[18]，本研究采用无溶剂微波和白木香内生真菌BotrysphaeriarhodinaA13发酵液浸泡沉香粗粉后通过水蒸气蒸馏法提取马来沉香挥发油，正交设计优化提取工艺条件，以期提高沉香挥发油提取率、降低成本，为水蒸气蒸馏法提取沉香挥发油的工业化生产提供基础数据。

1 试药与仪器

供试品、真菌发酵液均与文献[18]相同，供试品为瑞香科植物马来沉香A.malaccensisLamk.即A.agallochaRoxb.，符合进口沉香药材的质量标准[19]，真菌发酵液BotrysphaeriarhodinaA13[20]由广东省微生物研究所李浩华高级实验师鉴定并提供。

乙醚(分析纯，广州化学试剂厂)；正构烷烃混合对照品C7～C40(色谱纯，美国AccuStandard公司，DRH-008S-R2)。

Agilent7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)；HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Agilent公司)；PYX-250G-B智能编程光照培养箱(广东省韶关市科力实验仪器有限公司)；WBFY-205微波化学反应器(河南省巩义市予华仪器有限公司)；HH-6数显电子恒温水浴锅(江苏省金坛市宏华仪器厂)；JA2003A电子天平(万分之一，上海精天电子仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 挥发油乙醚萃取液GC-MS分析

2.1.1 色谱与质谱条件 色谱柱：HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度：260 ℃；载气：高纯度氦气；流速：1.0 mL/min；进样量：1.0 μL，不分流进样；升温程序：90 ℃，保温4 min，以1.5 ℃/min升温至130 ℃，保温20 min后以0.5 ℃/min升温至160 ℃，保温5 min后以1 ℃/min升温至180 ℃，保温5 min后以2 ℃/min升温至230 ℃，保温30 min。

调谐方式：标准调谐方式；离子源：EI；离子源温度：230 ℃；电子能量：70 eV；电离电压：1.0 kV；接口温度：240 ℃；质量扫描范围：45～500 m/z，溶剂延迟时间：5 min。

2.1.2 真菌发酵液水蒸气蒸馏乙醚萃取液制备 取B.rhodinaA13发酵液40 mL置250 mL圆底烧瓶中，加入蒸馏水10 mL，摇匀，置挥发油测定器中加热回流4 h，停止加热，静置片刻。将挥发油提取装置油水分离器中的液体转移至30 mL分液漏斗，加入乙醚4 mL，振摇提取2 min，静置分层，取上层溶液于5 mL量瓶中，用乙醚定容至刻度，摇匀后倒至蒸发皿中，35 ℃水浴加热挥干溶剂，用少量乙醚溶解，转移至1 mL量瓶中，加乙醚定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 水蒸气蒸馏乙醚萃取液制备 精密称定5.00 g 沉香粗粉(过2号筛，且不过3号筛)，置250 mL圆底烧瓶中，加入50 mL水，充分振荡摇匀后，静置12 h。摇匀，自“置挥发油提取装置中加热回流4 h”起按“2.1.2”项操作，即得。

2.1.4 微波联合真菌发酵液浸泡辅助水蒸气蒸馏乙醚萃取液制备 精密称定5.00 g沉香粗粉(过2号筛，且不过3号筛)，置100 mL具塞锥形瓶中，少量蒸馏水润湿后以微波功率300 W加热，然后加入B.rhodinaA13发酵液，摇匀，密封，35 ℃恒温浸泡，用水转移至250 mL圆底烧瓶，并加水补齐至50 mL溶液体积，摇匀，自“置挥发油提取装置中加热回流4 h”起按“2.1.2”项操作，即得。

2.2 单因素试验

2.2.1 粉碎粒径的考察 精密称定5.00 g样品3份，其中2份按2015年版《中国药典》规定分别制成过2号筛且不过3号筛、过3号筛的粗粉，另1份保持不变，固定发酵液浸泡时间12 h、料液比1∶10、提取时间4 h、微波2 min，按“2.1.2”项下方法提取挥发油，按“2.1.1”项下方法测得过2号筛且不过3号筛沉香粗粉出峰数多，总峰面积高。虽然药材粒径变小，表面积增大，溶剂渗入好，扩散速度加快，有利于有效成分的扩散，但是，随着粉碎程度不断增加，颗粒表面的挥发性成分易逸失，因此本文选择过2号筛且不过3号筛的粗粉作为粒径。

2.2.2 提取时间的考察 精密称定5.00 g沉香粗粉2份，固定发酵液浸泡时间12 h、料液比1∶10、微波2 min，分别进行水蒸气蒸馏提取4、8 h，结果表明提取2～4 h时出现黄色油滴，之后挥发油的油量增加不明显，说明挥发油基本提取完全，同时不同提取时间乙醚萃取液GC-MS总峰面积无差异，为节约时间，本文选择4 h作为水蒸气蒸馏提取时间。

2.2.3 真菌发酵液浸泡时间的考察 精密称定5.00 g样品粗粉6份，固定料液比1∶10、微波2 min、提取时间4 h，真菌发酵液于35 ℃恒温(基于沉香主产区东南亚气候条件)分别浸泡12 h和1、2、3、4、5 d，随着浸泡时间的延长，4 d所得挥发油乙醚萃取液的GC-MS总峰面积最大，且超过4 d观察到浸泡液变质的现象，故正交试验选择1、2、3、4 d进行考察。

2.2.4 料液比的考察 精密称定5.00 g样品粗粉6份，固定发酵液浸泡时间12 h、微波2 min、提取时间4 h，分别考察料液比1∶1、1∶4、1∶5、1∶6、1∶10、1∶12，蒸馏30 min左右出现黄色油滴，料液比为1∶6时乙醚萃取液的总峰面积最高，故正交试验选择1∶2、1∶4、1∶6、1∶8进行考察。

2.2.5 微波辅助萃取时间的考察 固定发酵液浸泡时间12 h、料液比1∶6、提取时间4 h，微波辅助时间40 s和1.5、2、3 min，蒸馏30 min左右出现黄色油滴，当微波辅助萃取时间大于等于3 min时，于空气中闻到沉香特有的芳香气味，提示沉香特征性成分的逸失，且1.5 min时总峰面积最大，故微波辅助时间选择0、1、1.5、2 min进行考察。

2.3 正交试验优化提取工艺

2.3.1 正交试验设计 在单因素试验基础上，选取发酵液浸泡时间(A)、料液比(B)、微波加热时间(C)3个因素进行考察，每个因素设计4个水平，以乙醚萃取液GC-MS总峰面积、总倍半萜类化合物峰面积和总芳香族化合物峰面积作为考察指标，设计L16(43)正交试验，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

注：料液比为样品原料质量与发酵液体积之比。

按“2.1.2”项下制备的真菌发酵液水蒸气蒸馏乙醚萃取液经GC-MS分析，出峰数为23个，总峰面积为1.09×108，共检出4个色谱峰，检出化合物质量分数最高的是芳香族化合物苯乙醇(21.03%)，其中仅含有少量与沉香水蒸气蒸馏萃取液共有的苄基丙酮(0.83%)(图1A)。按“2.1.3”项下制备的直接水蒸气蒸馏法乙醚萃取液经GC-MS分析，出峰数为97个，总峰面积为2.05×109，共检出30个色谱峰，检出物总质量分数为59.23%，总芳香族质量分数为0.20%，总倍半萜质量分数为58.83%(图1B)。

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal test results

6718755499441133211571647904197028.3656.7285.08113.44141.80170.16198.52丰度CBAt/min

A.B.rhodinaA13发酵液； B.马来沉香； C.微波结合B.rhodinaA13发酵液浸泡马来沉香。

图1水蒸气蒸馏挥发油乙醚萃取液GC-MS总离子流图

Figure1TIC of GC-MS in ether extract of steam distillation volatile oil

微波辅助联合真菌发酵液浸泡水蒸气蒸馏法正交试验16个样品经GC-MS分析，出峰数分别为182、171、167、220、158、154、168、169、164、154、153、168、162、153、164、159，总峰面积为1.79×109～7.59×109。共检出33个色谱峰，检出峰峰面积占总峰面积的比值(%)分别为69.10、68.39、67.99、59.58、68.27、69.47、63.98、61.48、65.87、67.82、67.62、60.92、68.36、67.71、66.06、64.11，其中总芳香族化合物的质量分数为0.77%～1.43%，总倍半萜为58.48%～68.31%，质量分数较高的化合物是喇叭醇(9.08%～13.34%)、γ-桉叶油醇(7.76%～11.45%)、6-isopropenyl-4,8a-dimethyl-1,2,3,5,6,7,8,8a-octahydro-naphthalen-2-ol(6.29%～7.68%)、马兜铃烯(4.17%～5.31%)和沉香螺醇(2.97%～3.93%)。

微波辅助联合B.rhodinaA13发酵液浸泡水蒸气蒸馏在不同工艺条件下所得萃取液出峰数变化较大，总峰面积为直接用水蒸气蒸馏法的0.87～3.70倍。以正交试验设计中总峰面积最高的15号样品为例(图1C)，出峰数为164个，总峰面积为7.59×109，为直接水蒸气蒸馏法的3.70倍，共检出33个色谱峰，检出物峰面积占总峰面积的66.06%，总芳香族质量分数为1.09%，总倍半萜质量分数为64.53%，2-(2-苯乙基)色酮类化合物质量分数为0.09%。

2.3.3 正交试验结果分析 由表2正交试验结果直观分析可见，影响因素主次顺序为发酵时间>微波时间>料液比，各因素的水平影响顺序为：A4>A2>A3>A1、B4>B3>B1>B2、C1>C2>C4>C3；另外，从表3方差分析结果可见，发酵液浸泡时间(A)对沉香挥发油提取有显著影响(P<0.05)，料液比(B)与微波时间(C)无明显影响。综合以上分析，确定最佳组合为A4B4C1，即沉香挥发油最佳提取工艺条件为发酵液浸泡4 d，料液比为1∶8，微波0 min。

表3 方差分析结果Table 3 Results of variance analysis

2.3.4 验证试验 以微波2 min方法(发酵液浸泡4 d，料液比为1∶8，微波2 min)为参照，采用优化工艺(发酵液浸泡4 d、料液比1∶8、微波0 min)进行验证试验，结果表明微波2 min方法总峰面积平均值为2.73×109(n=3，RSD为5.68%)，优化工艺的样品(n=3)总峰面积分别为0.97×1010、1.01×1010、1.09×1010，峰面积RSD为5.97%，为微波2 min方法的3.55～3.99倍。

3 讨论

3.1 内生真菌发酵液的选择

Fazila等[21]采用乳酸浸泡马来沉香可将挥发油的提取量从1.72%提升到4.74%。Monggoot等[22]用Lactobacillusbulgaricus、Streptococcusthermophilus、Saccharomycescarlsbergensis等培养液浸泡沉香(A.subintegraDing Hou.)粉末可提高水蒸气蒸馏法的提取率，经GC-MS分析主要成分为β-沉香呋喃、α-桉叶油醇、卡拉酮、α-沉香呋喃和沉香螺醇，推测是由于微生物的胞外酶活性引起的提取率增加。B.rhodinaA13为分离自白木香结香部位的内生真菌[20]，离体和在体诱导白木香试验结果表明，该真菌可高效诱导白木香形成沉香组分[23-28]。B.rhodinaA13诱导离体白木香枝条可形成5,9-二甲基-2-(1-甲基亚乙基)-环癸醇等倍半萜类化合物[23]；以白木香木屑为培养基接种B.rhodinaA13培养后从发酵产物中分离出6-羟基-7-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、6-羟基-2-(2-苯乙基)色酮、6-甲氧基 -2-(2-苯乙基)色酮等2-(2-苯乙基)色酮类次生代谢产物[24]；B.rhodinaA13诱导白木香树后，随着造香时间的增加，结香部位的醇溶性浸出物和苄基丙酮的含量均有增加[27]；甲酸结合B.rhodinaA13诱导白木香12个月可形成白木香醛、长马鞭草烯酮、古芸烯氧化物、愈创木醇、5，8-二羟基-2-(2-苯乙基)色酮等沉香特征性成分[28]。基于此，本研究选择B.rhodinaA13发酵液浸泡马来沉香辅助提取挥发油。

与未经真菌发酵液处理的水蒸气蒸馏提取法相比，微波辅助联合B.rhodinaA13发酵液浸泡处理后水蒸气蒸馏提取马来沉香挥发油经GC-MS分析，化合物种类明显增加，出峰数从97个增至220个色谱峰，新检出2-(2-苯乙基)色酮、6-羟基-2-(2-苯乙基)色酮和6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮等沉香特征性成分。B.rhodinaA13发酵液浸泡处理可提高沉香挥发油提取率，且其发酵液中苯乙醇、对羟基苯丙酸等主要次生代谢产物未在沉香挥发油萃取液中检测到，提取率的提高可能由B.rhodinaA13分泌的酶活性引起，这方面尚有待进一步研究。

3.2 正交试验评价指标选择与优化

受样品量所限，本研究所制得的沉香挥发油无法收集或读取体积，因而采用乙醚萃取液进行GC-MS分析。水蒸气蒸馏法提取的马来沉香挥发油以倍半萜和芳香族化合物为主，苄基丙酮、δ-愈创木烯、α-愈创木烯、沉香螺醇、γ-桉叶油醇、榄香醇为主要成分[6,21]。Ismail等[8]认为沉香挥发油的主要成分是倍半萜类化合物，其化学组成是沉香挥发油分级的主要参考依据，而本研究马来沉香经内生真菌发酵液浸泡处理后水蒸气蒸馏提取的沉香挥发油中总倍半萜化合物的质量分数在58.58%～67.58%，符合沉香挥发油的成分特征。但是，目前尚无如沉香螺醇等与沉香挥发油品质密切相关的倍半萜类化合物的对照品，因此无法建立适宜的含量测定方法。课题组前期工作中建立了沉香药材中特征性成分苄基丙酮的含量测定方法[27]，在本文中建立了沉香挥发油乙醚萃取液中苄基丙酮的含量测定方法，并且对文中16个试验样品进行了测定，将苄基丙酮含量与总峰面积进行相关性分析，结果表明二者无相关性，即苄基丙酮的含量与沉香挥发油提取出的化合物相对总量不相关。在工艺考察研究中，相同条件下获得的GC-MS色谱峰面积可间接体现挥发油提取量，16个正交试验样品总峰面积1.79×109～7.59×109之间，为直接水蒸气蒸馏法的0.87～3.70倍，差异明显。因此，本文选择总峰面积、倍半萜、芳香族化合物总峰面积作为考察指标。

课题组前期工作中，关于不同辅助提取方法提取马来沉香挥发油化学组成分析结果表明，发酵液浸泡3 d、料液比1∶5、微波2 min时水蒸气蒸馏法总峰面积3.31×109，为直接的真菌发酵液浸泡辅助方法的1.57倍，出峰数从111个色谱峰下降为103个色谱峰[18]。本文正交试验结果表明，发酵液浸泡时间对沉香挥发油提取有显著影响(P<0.05)，经验证试验表明，最佳工艺条件下即直接的真菌发酵液浸泡辅助方法，为相同条件下微波2 min辅助联合方法的3.55～3.99倍，出峰数从89个色谱峰上升为116个色谱峰。与直接的水蒸气蒸馏法、微波联合内生真菌发酵液浸泡辅助方法相比，内生真菌发酵液浸泡辅助水蒸气蒸馏法提取沉香挥发油简便、经济、环保、提取效率高，可为水蒸气蒸馏法提取沉香挥发油的工业化生产提供依据。

致谢：文中所用沉香样品由吴光明先生提供。