香榧种子抑制其发芽和生长的内源物筛选研究

刘 序 陈 黎 高捍东

(1. 南京林业大学林学院，江苏 南京 210037；2. 黄山学院生命与环境科学学院，安徽 黄山 245000)

香榧 (Torreyagrandis) 又称榧子等，是红豆杉科 (Taxaceae) 榧属的常绿乔木，雌雄异株，主要生长在浙江、安徽等较为湿润地区[1-2]，其树体枝繁叶茂，姿态美丽，种子营养丰富，味道香醇，集美容、药用等功效于一身[3]，是良好的园林树种和经济树种。但香榧种子的休眠时间较长且从花芽分化、受精到果实成熟的过程长达三年之久[4]，这极大地阻碍了对香榧的开发利用。

种子是植物生命中的重要阶段，许多自然界中的种子均存在休眠现象，种子中存在内源抑制物是导致种子休眠的主要原因之一[5-6]，种子的不同部位均可能存在内源抑制物，张茂林等[7]指出杜鹃花 (Rhododendronheamatodes) 种子休眠的主要原因是其种皮中含有内源抑制物。白柯君等[8]认为板栗 (Castaneamollissina) 种皮中含有的P-香豆酸可能是抑制种子萌发的主要原因之一。卢明艳等[9]指出天山鸢尾 (Irisloczyi) 种子的抑制物质主要存在于种皮中。GC-MS是用于检测种子中内源物质的一种有效方法，张艳杰等[10]利用GC-MS法检测出南方红豆杉 (Taxuschinensisvar.mairei) 种子的3个部位均存在某些内源物导致种子休眠，蒋玉婷[11]利用GC-MS法鉴定出导致斧翅沙芥 (Pugioniumdolabratum) 种子休眠的主要原因是种子和果皮中含萌发抑制物质。由于内源抑制物质导致种子休眠的研究在其他植物中也有研究[12-14]，但目前对香榧的研究主要集中于良种选育、栽培等方面[15]，其休眠方面的研究较少[16]。本研究通过萃取液提取香榧种子3种形态的内源物，并对其进行生物测定，分析各萃取液物质种类，探讨香榧种子内源物对其休眠的影响，以期为解除香榧种子深休眠提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香榧种子于2013年10月上旬采集于黄山市黄山区汤口镇 (海拔300～500 m)，树龄约120 a。采集后，去除种子的假种皮，水洗干净、自然干燥后储藏于4 ℃的冰箱中供试。生物测定使用市售纯度为96%、净度为98%、发芽率85%以上、含水量约7%的白菜 (Brassicapekinensis) 种子，甲醇、石油醚、乙醚和乙酸乙酯均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1材料初步分离

将供试种子分离为外种皮、内种皮、胚乳 (含胚) 3个部位，各取10 g，分别粉碎后参考蒋玉婷等[17]的方法进行初步分离，将得到的石油醚萃取液、乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和甲醇萃取液放入5 ℃的冰箱中备用。

1.2.2内源物鉴定

各取3 mL上述石油醚萃取液、乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液及甲醇萃取液，对其进行GC-MS分析。通过质谱系统检索并与标准谱图进行核对，对GC-MS分析得到的香榧种子3部位各有机相萃取液的总离子流色谱图进行分析，可得到香榧种子3个部位各有机相萃取液中内源物的种类以及相对含量。

GC-MS分析使用气相-质谱连用仪 (Agilent HP7890-5975C)，其载气为高纯He，体积流量设为1 mL/min；采用HP-5MS弹性石英毛细管柱30 m × 250 μm × 0.25 μm，起始温度为40 ℃测定3 min，接着用4 ℃/min到160 ℃测定3 min，最后6 ℃/min到285 ℃测定10 min；进样温度280 ℃，进样量1 μL。由计算机控制的库存信号检索各个成分的质谱图并参考保留值。

1.2.3内源物抑制种子发芽及生长筛选实验

在直径为9 cm垫有滤纸的培养皿中分别加3 mL香榧种子外种皮、内种皮和胚乳的各相萃取液，待各相有机溶剂挥发干后 (水相除外)，加3 mL蒸馏水，并以同体积的蒸馏水作为CK，每个处理重复3次，每个重复100粒白菜种子，放入25 ℃、1 200 lx恒温光照培养箱内培养，48 h后统计白菜种子的发芽率 (以露出子叶为发芽的标准)，72 h后测量其胚根长和苗高。

2 结果与分析

2.1 萃取液中内源物分析

2.1.1石油醚萃取液中内源物种类及相对含量分析

由表1可知，香榧种子3个部位石油醚萃取液分别分离出10、11和11种物质，选择离子流色谱图中峰面积大、质谱图与计算机检索谱库图相似度大、可能对香榧种子发芽具有抑制作用的内源物7、8和8种。其中外种皮中含量较大的为环己烷、3-甲基己烷、二甲基环戊烷、甲基环己烷、未知1、庚烷；内种皮中含量较大的为环己烷、3-甲基己烷、甲基环己烷、二甲基环戊烷、1, 2-二甲基环戊烷、庚烷、未知；胚乳中含量较大的为环己烷、二甲基环戊烷、3-甲基己烷、甲基环己烷、庚烷、1，2-二甲基环戊烷。可见，香榧种子3个部位石油醚萃取液中的内源内源物基本都是烷类，其中含量较多的是环己烷、甲基环己烷、3-甲基己烷、二甲基环戊烷、1, 2-二甲基环戊烷、庚烷。说明香榧种子3个部位内源物中含有多种烷类物质，而这些烷类物质极可能是导致香榧种子休眠的内源抑制物，但究竟是哪种物质起关键作用还需找到标准品进一步验证。

表1 香榧种子3个部位石油醚萃取液中内源物种类及相对含量Table 1 Compound kinds and their relative content in petroleum ether of 3 parts of T.grandis

2.1.2乙醚萃取液中内源物种类及相对含量分析

香榧种子3个部位乙醚萃取液分别分离出1、0和1种物质。其中，外种皮和胚乳中仅检测出2, 6-二叔丁基对甲酚，分子式为C15H24O，分子量为220，含量为100%；内种皮乙醚萃取液中未检测出内源物。许多研究提出酚类化合物是种子中抑制作用较强的物质，这可能也是外种皮、胚乳乙醚萃取液对白菜种子发芽率与幼苗生长有抑制作用，而内种皮乙醚萃取液对其无明显抑制作用的原因，说明香榧种子外种皮和胚乳中含有的该种酚类内源物极可能是导致其休眠的内源抑制物，而该种酚类物质对香榧种子的萌发是否有抑制作用以及抑制作用大小需要找到标准品才能进一步确认。

2.1.3乙酸乙酯萃取液中内源物种类及相对含量分析

由表2可知，从香榧种子3个部位乙酸乙酯萃取液,分别分离出2、1和3种物质，分子式均为C5H10O2，分子量均为102。其中，外种皮检测出丙酸乙酯、乙酸丙酯；内种皮检测出丙酸乙酯；胚乳中检测出丙酸乙酯、醋酸异丙酯、乙酸丙酯。可见，香榧种子胚乳中含有一种内源物，即醋酸异丙酯，是外种皮和内种皮中所不含有的，这可能是香榧种子3部位乙酸乙酯提取物生物测定中胚乳乙酸乙酯提取物对白菜种子发芽率和幼苗生长抑制作用最强的原因。香榧种子胚乳中所含的醋酸异丙酯极可能为导致香榧种子休眠的内源抑制物，但其对香榧种子萌发的抑制作用大小还需要找到标准品才能进一步确认。

表2 香榧种子3个部位乙酸乙酯萃取液中内源物种类及相对含量Table 2 Compound kinds and their relative content in ethyl acetate phase of 3 parts of T.grandis

2.1.4甲醇萃取液中内源物种类及相对含量分析

由表3可知，从香榧种子3个部位甲醇萃取液分离出1、39和2种物质，分别选择离子流色谱图中峰面积较大、质谱图与计算机检索谱库图相似度较大的、可能对香榧种子发芽具有抑制作用的内源物1、11和1种。其中，外种皮仅检测出环己烷；内种皮中含量较大的为环己烷、3-甲基己烷；胚乳检测出邻苯二酚。此外，内种皮中还含有醇类、酸类、烯类、脂类、胺类、醚类及一些未知物质的存在。生物测定结果显示，种皮甲醇萃取液中所含的烷类物质以及胚乳甲醇萃取液中所含的邻苯二酚对白菜种子的发芽率和幼苗生长的抑制作用最强，抑制率为100%，说明香榧种子中含有的烷类物质和邻苯二酚极可能是导致香榧种子休眠的内源抑制物，其中，邻苯二酚已被证实是西洋参种子中的萌发抑制物，而其他烷类物质是否抑制种子萌发以及和种子休眠的关系还需进一步验证。

表3 香榧种子3个部位甲醇萃取液中内源物种类及相对含量Table 3 Compound kinds and their relative content in methanol extracts of 3 of T.grandis

2.2 内源物对白菜种子发芽和幼苗生长的影响

2.2.1内源物对白菜种子发芽率的影响

由表4可知，与CK相比，外种皮中石油醚、乙醚萃取液和乙酸乙酯萃取液处理的白菜种子发芽率分别减少了9.66%、11.66%和10.45%，用甲醇萃取液处理的白菜种子无一粒发芽。这说明外种皮内源物对白菜种子发芽均有抑制作用，其中甲醇萃取液中内源物对白菜种子抑制作用最大，石油醚萃取液、乙醚萃取液和乙酸乙酯萃取液中内源物对白菜种子抑制作用几乎相同。

香榧内种皮各萃取液中，用石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液处理的白菜种子发芽率与CK相比分别减少了4.33%和7.66%，而用乙醚萃取液处理的白菜种子发芽率比CK多1%，用甲醇萃取液处理的白菜种子无一粒发芽。这说明内种皮石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和甲醇萃取液种内源物对白菜种子的发芽有抑制作用，抑制作用大小为甲醇萃取液内源物 > 乙酸乙酯萃取液内源物 > 石油醚萃取液中内源物，而乙醚萃取液内源物对白菜种子的萌发无抑制影响。

香榧胚乳各萃取液中，用石油醚萃取液、乙醚萃取液和乙酸乙酯萃取液处理白菜种子发芽率与CK相比分别减少13%、24.33%和68.33%，用甲醇萃取液处理的白菜种子无一粒发芽。这说明胚乳各萃取液中内源物对白菜种子萌发均有抑制作用，抑制作用大小分别为甲醇萃取液中内源物 > 乙酸乙酯萃取液中内源物 > 乙醚萃取液中内源物 > 石油醚萃取液中内源物。

方差分析结果 (表4) 表明，除了内种皮乙醚萃取液对白菜种子发芽率的影响不显著外，其他各项均存在显著 (P< 0.05) 或极显著差异 (P< 0.01)，这说明外种皮、内种皮和胚乳中均存在抑制种子萌发的物质。外种皮、内种皮和胚乳的不同相态对白菜种子发芽率抑制作用不同的原因可能是香榧种子外种皮、内种皮和胚乳的不同相态萃取液中含有的抑制物质不同或所含抑制物质浓度不同。

2.2.2内源物对白菜幼苗胚根长的影响

香榧种子3个部位萃取液处理白菜幼苗胚根长存在不一致性，结果如表4。外种皮中石油醚萃取液、乙醚萃取液和乙酸乙酯萃取液处理白菜幼苗胚根长分别为35.71、35.11 mm和31.48 mm，均小于CK。香榧种子内种皮中石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液处理白菜幼苗胚根长分别36.03 mm和38.75 mm，小于CK，乙醚萃取液处理的白菜幼苗胚根长为41.04 mm，略大于CK。香榧种子胚乳中石油醚萃取液、乙醚萃取液和乙酸乙酯萃取液处理白菜幼苗胚根长分别为38.85、24.62 mm和15.18 mm，均小于CK。方差分析结果 (表4) 表明，与CK相比，胚乳石油醚萃取液、内种皮乙酸乙酯萃取液对白菜幼苗胚根长无显著差异外，其他各指标之间均存在显著 (P< 0.05) 或极显著差异 (P< 0.01)。可见，除了胚乳石油醚萃取液、内种皮乙酸乙酯萃取液中内源物对白菜幼苗胚根生长无影响外，外种皮、内种皮和胚乳的其他各萃取液中均存在影响胚根生长的物质。

表4 香榧3个部位内源物对白菜种子发芽率及幼苗生长的影响Table 4 Effects of the extract from 3 parts of T.grandis seed on the percentage germination and seedling growth of B.pekinensis seedlings

注：不同小写字母表示差异显著，不同大写字母表示差异极显著。

2.2.3香榧种子各部分内源物对白菜幼苗苗高的影响

香榧种子的3个部位萃取液处理的白菜幼苗苗高存在不同，结果如表4。外种皮中石油醚萃取液、乙醚萃取液和乙酸乙酯萃取液处理白菜幼苗苗高分别为12.24、12.09 mm和12.76 mm，与CK差距不大。香榧种子内种皮中石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液处理白菜幼苗苗高分别为11 mm和11.65 mm，均小于CK，乙醚萃取液处理的白菜幼苗苗高为12.29 mm，与CK基本相同。香榧种子胚乳中石油醚萃取液、乙醚萃取液和乙酸乙酯萃取液处理白菜幼苗苗高分别为11.34、9.14 mm和8.76 mm，均小于CK。方差分析结果 (表4) 表明，与CK相比，外种皮石油醚萃取液、乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和内种皮乙醚萃取液对白菜幼苗苗高生长作用无明显差异外，其他各指标之间均存在显著 (P< 0.05) 或极显著差异 (P< 0.01)。

3 结论与讨论

自然状态下的香榧种子存在一定的深休眠性，即使给予适宜的水分和温度条件，经历一段时间仍不能正常萌发。Kentzen[5]和Li等[6]曾指出种子中存在抑制物质是影响种子休眠的主要原因之一。

本实验以白菜种子为指示植物，萃取出香榧种子3个部位的内源物，并对其进行了生物测定。香榧种子3个部位萃取液对白菜种子的发芽率和幼苗生长均存在不同程度的影响，其中3个部位甲醇萃取液处理白菜种子无一粒发芽，抑制作用最强，抑制率达到100%，说明香榧种子3个部位甲醇萃取液中均含有某些萌发抑制物质，对种子萌发和幼苗生长的抑制作用最强，这与张艳杰等[18]的研究结果一致。对各萃取液抑制作用进行比较，胚乳各萃取液对白菜种子发芽率和幼苗生长抑制作用强弱程度依次为甲醇萃取液 > 乙酸乙酯萃取液 > 乙醚萃取液 > 石油醚萃取液，且胚乳各萃取液对白菜种子发芽率和幼苗生长的影响均与CK存在显著 (P< 0.05) 或极显著差异 (P< 0.01)，这说明香榧种子胚乳中存在抑制其萌发的物质，这与张翔宇等[19]对大花黄牡丹种子休眠原因的研究结果一致。

外种皮各萃取液对白菜种子发芽率抑制作用强弱程度依次为甲醇萃取液 > 乙醚萃取液 > 乙酸乙酯萃取液 > 石油醚萃取液，外种皮各萃取液对白菜种子胚根长抑制作用强弱程度依次为甲醇萃取液 > 乙酸乙酯萃取液 > 乙醚萃取液 > 石油醚萃取液。而外种皮各乙酸乙酯萃取液、乙醚萃取液、石油醚萃取液对白菜幼苗苗高的影响与CK相比无显著影响，说明除了甲醇萃取液中存在明显抑制白菜种子萌发和幼苗生长的物质，其他萃取液对白菜种子发芽率和幼苗胚根生长的抑制作用较弱，对白菜幼苗的苗高生长无明显抑制作用。

内种皮各萃取液对白菜种子发芽率抑制作用强弱程度依次为甲醇萃取液 > 乙酸乙酯萃取液 > 石油醚萃取液，内种皮各萃取液对白菜幼苗生长抑制作用强弱程度依次为甲醇萃取液 > 石油醚萃取液 > 乙酸乙酯萃取液，说明内种皮甲醇萃取液、乙酸乙酯萃取液、石油醚萃取液均存在抑制其萌发的物质，而内种皮乙醚萃取液萃取液处理的白菜种子的发芽率、幼苗的苗高和胚根生长均高于CK，说明内种皮乙醚萃取液中可能存在促进白菜种子萌发和幼苗生长的物质，但是具体哪种物质起作用还需进行进一步的研究。

GC-MS检测结果表明，从香榧种子的外种皮、内种皮和胚乳中检测出多种内源物，主要物质有烷类、酚类、醇类、酸类等。其中，外种皮和胚乳的乙醚萃取液中含有2, 6-二叔丁基对甲酚，含量为100%，而胚乳中不含该物质，说明2, 6-二叔丁基对甲酚极可能是导致香榧种子休眠的抑制物质；外种皮和胚乳的石油醚萃取液中的二甲基环戊烷含量较高，均大于13%，而胚乳中含量较低，为9.41%，说明该物质的含量可能与香榧种子的休眠有关；胚乳的甲醇萃取液浸提液中检测出邻苯二酚，其抑制作用已被证实是西洋参种子中的发芽抑制物质[20]，其他物质的是否抑制种子萌发以及和种子休眠的关系还需进一步研究。

生物测定结果表明，外种皮和胚乳中的内源物对香榧种子萌发的抑制作用较强，而内种皮中的内源物对香榧种子萌发的抑制作用较弱，年慧慧等[21]研究指出影响南方红豆杉萌发的主要原因之一是外种皮和胚乳中含有抑制物质，其与本研究的结果存在一致性。

综上所述，研究初步确定香榧种子3个部位中存在抑制物质是导致其种子休眠的重要原因之一，其中邻苯二酚的抑制活性已在西洋参种子中被前人证明，其他物质的抑制作用及与香榧种子休眠的关系还需要进一步研究，从而为打破香榧种子的休眠提供理论依据。

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