碱性β-甘露聚糖酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

汤文晶，李松，马忠宝，杨倩，汤斌

(安徽工程大学 生物与化学工程学院，安徽 芜湖，241000)

半纤维素(hemicellulose)是植物细胞壁主要组分之一，由甘露聚糖、木聚糖及少量半乳聚糖和阿拉伯聚糖组成[1]。半纤维素的有效水解，对改善木质纤维素结构、提高资源利用率、制备功能性寡糖等具有重要意义[2]。

β-甘露聚糖酶(β-mannanase; EC3.2.1.78)是半纤维素酶的一种，可催化水解β-1,4甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖分子中的β-1,4甘露糖苷键，以释放甘露糖或制备功能性甘露低聚糖[3]，因而被广泛应用于饲料、造纸、食品和木质纤维素燃料乙醇等行业[4-6]。自然界β-甘露聚糖酶主要来源于微生物，包括曲霉属(Aspergillussp.)[7]、青霉属(Penicilliumsp.)[8]、木霉属(Trichodermasp.)[9]等丝状真菌以及芽孢杆菌属(Bacillus)[10-11]和放线菌属(Actinomyces)[12-13]等细菌。真菌甘露聚糖酶作用pH值范围一般为酸性至中性，细菌甘露聚糖酶多为中性至碱性。其中，碱性β-甘露聚糖酶因在碱性条件下具有较好的耐受性和催化活力，从而在造纸[14]、苎麻脱胶[15]、洗涤[2]和石油开采[16]等特殊行业中具有广泛应用前景。

本文从不同土样中筛选得到多株产β-甘露聚糖酶碱性细菌，对其进行菌种鉴定和摇瓶发酵条件优化，为进一步实施β-甘露聚糖酶基因克隆、异源表达和放大发酵奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

从芜湖市神山公园、滨江公园、镜湖湖边等土壤中筛选分离得到多株碱性细菌并保藏。

1.1.2 培养基

LB培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 5，pH 6.8。

碱性细菌筛选培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 5，KH2PO41，琼脂20，pH 9.0。

初筛培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 5，KH2PO41，魔芋粉3，琼脂20，pH 9.0。

种子培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 5，KH2PO41，pH 9.0。

发酵培养基(g/L)：魔芋粉10，酵母粉8，NaCl 5，KH2PO41，MgSO40.1，pH 9.0。

所有碱性培养基均使用Na2CO3调节pH，培养基配制完成后于121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 试剂

麦芽糖、可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨、琼脂粉、甘露糖等，国药集团化学试剂有限公司；魔芋粉(食品级)，当地超市；T-载体、T4 DNA连接酶、TaqDNA聚合酶，宝生物工程(大连)有限公司；16S rDNA PCR扩增通用引物(27F和1492R)，上海生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 仪器与设备

TC312 PCR仪，美国TECH公司；EC3I UVP凝胶成系统，美国UVP公司；64R高速冷冻离心机，美国Beckman-Coulter公司；QHZ-123B组合式全温度振荡培养箱，太仓市华美生化仪器厂；723可见分光光度计，上海菁华科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株筛选

碱性细菌初筛：分别称取0.1 g土样置于1.5 mL离心管，加入1 mL无菌水后充分振荡混匀，静置10 min吸取100 μL上层液涂布于到碱性细菌筛选培养基，在37 ℃恒温箱中静置培养约24 h。

产β-甘露聚糖酶细菌筛选：将筛选所得碱性细菌分别点种至初筛培养基中，37 ℃培养24 h后加入5 mL稀碘液(碘3 g/L+碘化钾6 g/L)，染色5 min后倾去稀碘液并通过测量D/d值(透明圈直径/菌落直径)，选取D/d值较大菌株进行纯化和后续试验。

1.3.2 形态特征及大分子水解实验

筛选菌株显微观察和大分子水解等实验参照《微生物学实验》[17]所述方法和步骤进行。

1.3.3 菌株的分子生物学鉴定

细菌染色体DNA的提取、质粒DNA小量制备及DNA连接、转化等分子操作按文献[18]进行。以染色体DNA为模板，以27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1429R(5′-GGTTACCTTGTTACGACT T-3′)为上下游引物，在54 ℃退火温度下进行扩增，PCR产物经纯化后连接入T-载体，提取重组质粒并送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因序列测定。通过在线数据库Blast/blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)对测定序列进行比对，选择同源性较高的序列利用BioEdit软件进行ClustalW多重比对(重复计算1 000次)，并进一步使用MEGA 5.0软件通过Neighbor-Joining(NJ)法构建系统发育树。

1.3.4 摇瓶发酵复筛

摇瓶发酵条件：挑取单菌落接入种子培养基30 mL/250 mL，于37 ℃、200 r/min下培养16 h，按3%比例接入发酵培养基50 mL/250 mL并于37 ℃、200 r/min下发酵36 h，测定β-甘露聚糖酶活力。

生长过程曲线绘制：将分离菌株分别接种至pH 9.0和pH 10.0种子培养基中，于37 ℃、200 r/min条件下进行培养。定期取样测定培养液细胞密度(OD600)，以培养时间为横坐标，以吸光度OD600为纵坐标，绘制菌株生长过程曲线。

粗酶最适反应pH和温度测定：在上述酶活力测定条件下，分别将缓冲液pH调整为8.5、9.0、9.5、10.0和10.5，以研究pH值对酶催化活力的影响；分别将反应温度调整为35、40、45、50和55 ℃，以研究温度对酶催化活力的影响。分别以不同pH或温度测定条件下所获得的最高酶活力为100%，计算相对酶活力，以确定酶的最适反应pH和温度。

综合筛选菌株对碱性pH的耐受性、酶的最适作用温度和pH等特性，择优选择菌株进行后续研究。

1.3.5 β-甘露聚糖酶活力测定

取0.6 mL 5 g/L魔芋粉水溶液与0.6 mL甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2 mol/L，pH 9.0)混合，于40 ℃预热5 min后加入稀释酶液0.2 mL，于40 ℃反应30 min并利用DNS试剂显示法[19]测定还原糖生成量，还原糖浓度以甘露糖为标准物计算。以灭活(90 ℃保温20 min)酶液为空白对照，计算酶活力。酶活定义：在上述测定条件下，每分钟生成1 μmol还原糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。

1.3.6 摇瓶发酵条件优化

单因素优化：在1.3.4所述摇瓶发酵条件中，分别将碳源(10 g/L)调整为可溶性淀粉、糊精、玉米淀粉、麦芽糖，研究不同碳源对菌株产酶的影响；将氮源(8 g/L)调整为蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、NH4Cl、NH4NO3，研究不同氮源对菌株产酶的影响；将发酵液初始pH调节至8.5～10.5，研究pH对发酵产酶的影响；使用10%～50%的装液量，研究不同装液量对发酵产酶的影响。

正交实验设计：结合单因素实验优化结果，分别选取魔芋粉、酵母粉、无机离子和pH等4个因素进行L9(34)正交设计。

2 结果与分析

2.1 菌株初筛及形态学观察

经初筛共获得20株碱性细菌，进一步复筛得到8株在含有魔芋粉培养基中可以产生透明圈的菌株。其中，编号为AM1、AM3和AM7的3株菌D/d值较大，如图1-a所示。

经划线分离观察菌落形态可知，菌株AM1单菌落呈圆形，乳白色，表面光滑，边缘整齐，中间凸起；菌株AG3菌落呈圆形，深黄色，表面光滑，边缘整齐，中间凸起；菌株AG7单菌落呈圆形，淡黄色，表面光滑，边缘整齐。扫描电镜结果表明，3个菌株的形态较为相似，均为短杆状，长2～3 μm，宽约0.5 μm，如图1-b～d所示。其中，菌株AM1和AM3菌体较为饱满且两端呈明显的椭圆状。

a-菌落透明圈；b- AM1；c- AM3；d- AM7图1 3株碱性细菌在初筛培养基中经染色后产生的透明圈照片(a)及菌体细胞5 000倍SEM显微照片(b～d)Fig.1 Picture of transparent circle formed after staining(a) and 5 000-fold SEM micrograph for the three isolated alkaline bacteria cells (b-d)

大分子水解实验研究表明，3个菌株对羧甲基纤维素钠、木聚糖和可溶性淀粉等大分子底物均具有水解作用，但都不能水解油脂，如表1所示。

表1 3株碱性细菌大分子水解实验结果Table 1 Experimental results of hydrolysis of macromol- ecule by the three isolated alkaline bacteria

注：“+”号表示菌株对底物的水解程度；“-”号表示菌株对底物无水解能力。

2.2 菌株复筛

生长过程曲线研究表明，菌株AM1、AM3和AM7在pH 9.0条件下发酵12 h后细胞密度(OD600)分别达到3.69、2.49和2.62；在pH 10.0条件下最高OD600分别为2.02、1.79和2.08，如图2所示。

图2 3株碱性细菌分别在pH 9.0和pH 10.0条件下的生长过程曲线Fig.2 Growth curve of the three isolated alkaline bacteria which were cultivated under pH 9.0 and pH 10.0,respectively

发酵36 h后，菌株AM1、AM3和AM7发酵液中甘露聚糖酶活力分别为80、36和19 U/L。粗酶性质研究表明，菌株AM1、AM3和AM7所产甘露聚糖酶最适作用温度均在50 ℃左右(图3-a)，最适作用pH分别为9.5、9.5和9.0(图3-b)。因此，综合各菌株生长、产酶及酶性质等特点，选择相对较优菌株AM1作为出发菌株进行后续研究。

图3 三株碱性细菌所产甘露聚糖酶的最适作用温度(a)和pH(b)Fig.3 The optimum temperature (a) and pH (b) of mann-anase produced by the three isolated alkaline bacteria

2.3 分子生物学鉴定

以菌株AM1染色体DNA为模板进行PCR扩增，获得16S rDNA大小约为1.6 kb，如图4-a所示。经测序、同源比对(Blastn)和系统发育树分析表明，菌株AM1与芽孢杆菌属(Bacillus)同源性较高，在鉴定到种的菌株中与一株科氏芽孢杆菌标准菌株(B.cohniiDSM 6307)染色体中15个区域(range)序列平均同源性最高(GenBank登录号：CP018866.1；Identity：96.54%)，且与B.cohnii处于同一发育地位，如图4-b所示。

a- PCR产物凝胶电泳;b-菌株AM1 16S rDNA系统发育树;1-以基因组DNA为模板扩增结果；2-以重组T-载体为模板扩增结果；M-DNA分子标准对照图4 菌株AM1 16S rDNA PCR产物凝胶电泳Fig.4 Gel electrophoresis of 16S rDNA PCR products for strain AM1

因此，结合形态学和系统发育树分析，将AM1鉴定为一株科氏芽孢杆菌，并命名为科氏芽孢杆菌AM1(B.cohniiAM1)。

2.4 单因素试验

单一碳源产酶研究表明，菌株AM1利用魔芋粉发酵产酶水平最高，显著高于其他碳源(图5-a)，可能因为魔芋粉不仅可以作为碳源使用，还对甘露聚糖酶的表达具有底物诱导作用；单一氮源研究表明，利用酵母粉所得产酶水平最高(图5-b)。同时，菌株AM1分别在pH 9.5和装液量为30%(75 mL/250 mL)条件下获得发酵产酶水平最高，分别如图5-c和图5-d所示。

图5 不同碳源(a)、氮源(b)、pH(c)和装液量(d)对菌株AM1发酵产甘露聚糖酶的影响Fig.5 Effect of different carbon sources (a), nitrogen sources(b), pH values (c) and loading volumes (d) on the production of mannanase by strain AM1

2.5 正交试验优化

为综合考察多种因素对菌株AM1发酵产甘露聚糖酶的影响，进一步选取魔芋粉、酵母粉、无机离子和pH等4因素进行3水平正交优化试验。选择L9(34)正交表进行水平组合处理设计，正交试验数据分析如表2所示。

表2 菌株AM1发酵产甘露聚糖酶正交试验结果Table 2 Orthogonal test of mannanase production by strain AM1

结果表明在所设定试验条件下，各因素影响产酶水平主次顺序为：A>B>C>D，即魔芋粉>酵母粉>无机离子种类>初始pH；产甘露聚糖酶优选发酵条件为A2B3C1D2，即(g/L)：魔芋粉6，酵母粉15，MgSO40.1，初始pH 9.5时，最高酶活力达到345 U/L，为优化前产酶水平的4.3倍。

3 结论与讨论

本文通过自然筛选方式，从不同土样中筛选得到20株碱性细菌并获得3株具有碱性β-甘露聚糖酶分泌能力菌株，进而对其中1株产酶水平较高且性质相对较好的菌株AM1进行分子生物学鉴定和发酵产酶条件研究。结合同源序列比对和系统发育树分析，将菌株AM1鉴定为1株科氏芽孢杆菌(B.cohnii)，其在pH 9.0条件下生长较好，所产β-甘露聚糖酶具有较高最适作用温度(55 ℃)和pH(9.5)，与多数细菌甘露聚糖酶最适作用pH(中性至碱性)[2]相比，菌株AM1所产甘露聚糖酶最适作用pH相对较高，且在pH 9.0～9.5范围内具有较大催化活力(>80%)，在碱性加工工艺中可能更具有应用优势。优化得到发酵培养条件为：魔芋粉6 g/L，酵母粉15 g/L，MgSO40.1 g/L，初始pH为9.5，装液量为30%，所得β-甘露聚糖酶发酵水平达到345 U/L。研究结果可为碱性β-甘露聚糖酶产生菌株的筛选和放大发酵培养提供参考，为后期碱性β-甘露聚糖酶编码基因的克隆及异源表达等相关研究提供良好的菌种资源。