组蛋白H3甲基化修饰与精子发生的研究进展

王龙达 罗启睿 赵树华

（1 昆明医科大学第一附属医院生殖遗传科，云南 昆明 650031；2 云南大学附属中学呈贡校区，云南 昆明 650500）

1 前言

哺乳精子发生是一个复杂独特的过程。以小鼠为例，精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSC）分化为精原细胞前体（progenitor spermatogonia），随后经A型精原细胞（spermatogonia）、B型精原细胞进入减数分裂，减数分裂Ⅰ期包括四个阶段初级精母细胞（spermatocyte）：细线期（leptotene）、偶线期（zygotene）、粗线期（pachytene）和双线期（diplotene），然后第二次减数分裂分裂为4个圆形精子细胞（round spermatid），经形态和染色体巨变特化为精子[1]。在这一复杂的过程中，每个阶段都涉及大量的特异基因表达和关闭，这些基因的调控广泛依赖于表观遗传。越来越多的证据表明，组蛋白修饰与男性不育相关，组蛋白修饰异常影响正常精子发生[2]。

组蛋白修饰是重要的表观遗传修饰机制，包括组蛋白甲基化（methylation，me）、乙酰化（acetylation，ac）、磷酸化（phosphorylation）、泛素化（ubiquitination）等，参与了基因转录调控和染色质结构等众多调控过程[2]。蛋白甲基化存在于赖氨酸（Lysine，K）和精氨酸（Arginine，R）残基，分别通过赖氨酸甲基化转移酶（protein lysine methyltransferases，PKMTs）或精氨酸甲基化转移酶（protein arginine methyltransferases，PRMTs）将甲基从供体Ado-Met转移到蛋白残疾上[2]。组蛋白甲基化是研究最多的翻译后修饰，不同位点的甲基化代表了不同的染色质状态，在精子发生的多个阶段发挥重要作用[2]。H3是甲基化修饰最普遍、研究最多的组蛋白。为更好的理解精子发生过程，本文拟综述H3组蛋白各甲基化位点在睾丸中的分布及功能。

2 结果

2.1 精子H3组蛋白修饰与不育：精子发生过程中，单倍体的精子细胞染色质经历剧烈变化，90%～95%核小体组蛋白先被转换蛋白替换（transition protein，Tnp），然后被鱼精蛋白替换（protamine，Prm）[2]。鱼精蛋白使染色质形成紧密的结构，防止DNA损伤和突变[2]。残留组蛋白也具有重要功能，残留比例与男性不育相关。有研究表明，精子H3组蛋白27位赖氨酸残基三甲基化（H3K27me3）与公牛生育力相关[3]。此外，通过染色质免疫共沉淀-基因芯片分析，发现高生育力水牛和低生育力水牛精子中有很多基因的H3K4me2和H3K27me3存在显著性差异[4]。另外，在精子中残留的组蛋白有一重要作用是通过H3K4me3（激活标记）和H3K27me3（抑制标记）使在胚胎早期发育中起重要作用的基因维持“二价”状态，以在受精后顺利激活表达，促进胚胎发育[2]。

2.2 H3K27甲基化修饰在精子发 生中的作用：H3K27甲基化是抑制性组蛋白修饰，在各级生精细胞中均有分布，主要通过Polycomb抑制复合体2（Polycomb repessive complex 2，PRC2）催化完成[5]。PRC2包括4个主要组分：EZH1/2、EED、SUZ12、和RBBP4/7[6]。在生精细胞中特异敲除PRC2核心基因Eed和Suz12都导致小鼠不育，表型相似，表现为睾丸体积显著减小，组织切片显示精母细胞数量大幅下降，且多数细胞核不规则，粗线后精母细胞和圆精子完全缺失[7]。PRC2另一个核心组分EZH1和EZH2的同时敲除，也导致H3K27me3下降和减数分裂阻滞[8]。精子发生的早期，从精原干细胞分化到减数分裂起始，需要开启一组基因转录。如Stra8在这一有丝分裂到减数分裂转换过程中起着至关重要的作用[9]。组蛋白修饰参与Stra8的表达调控，Stra8启动子的H3K27me3修饰在精原干细胞分化和减数分裂起始阶段降低，随着减数分裂的进行，在精母细胞中H3K27me3又上升，Stra8表达下降[7]。在小鼠中的研究结果表明，H3K27甲基化参与了精原干细胞维持，减数分裂前期转换，减数分裂染色体配对、联会和交叉等过程[7-8]。

2.3 H3K4甲基化修饰在精子发生中的作用：H3K4的二甲基化（H3K4me2）和三甲基化（H3K4me3）是基因激活的标记，由不同的甲基化酶和去甲基化酶调控[10]。H3K4me3主要分布在减数分裂起始阶段的B型精原细胞、细线期和偶线期精母细胞，以及精子形态发生阶段的圆形和长形精子细胞中[10]。KMT2在生精细胞中表达，催化H3K4me2。敲除Kmt2的小鼠不育，生精细胞渐进性缺失[10]。H3K4me2在精原干细胞维持中具有重要功能。PRDM9催化H3K4me2三甲基化，敲除Prdm9导致H3K4me3降低，减数分裂阻滞，雄鼠不育[11]。进一步研究发现H3K4me3参与调控染色体同源配对和性小体（sex body）生成[11]。此外，H3K4me3还参与组蛋白-鱼精蛋白替换，PYGO2蛋白识别H3K4me3并特异定位于长形精细胞核中[12]。小鼠中，Pygo2敲除影响转换蛋白（Tnp）和鱼精蛋白（Prm）表达，导致细胞核凝集异常，进而导致不育。PYGO2通过识别H3K4me3促进H3乙酰化，进而促进组蛋白-鱼精蛋白替换[12]。此外蛋白PHF7蛋白也可以识别H3K4me2/3，催化H2A泛素化促进组蛋白-鱼精蛋白替换[13]。以上结果说明，H3K4甲基化主要参与了精原干细胞维持/分化，减少分裂，组蛋白-鱼精蛋白替换等重要的精子发生过程。

2.4 H3K9甲基化修饰在精子发生中的作用：H3K9三甲基化（H3K9me3）是抑制性组蛋白修饰，多发生于异染色质区域。H3K9me3主要分布在所有生精细胞中具有分布[14]。SUV39H1和SUV39H2在中心粒外周异染色质区域催化H3K9三甲基。Suv39h1广泛表达，而Suv39h2在睾丸特异表达。同时敲除这两个基因，导致异染色质松散，进而同源染色体无法配对，减少分裂异常，雄鼠不育[11]。SETDB1是另一个催化H3K9三甲基化的酶，该酶缺失导致精原干细胞凋亡。SETDB1通过调控PTEN/AKT/FOXO1通路抑制维持精原干细胞。SETDB1可以与AKT结合，并调控 Bim 和Pten基因H3K9me3抑制它们的表达，进而抑制细胞凋亡[14]。JHDM2A是一个H3K9me2/1特异的去甲基化酶，小鼠中Jhdm2a基因的缺失，导致精细胞染色质凝集异常，从而导致不育。JHDM2A直接与转换蛋白（Tnp1）和鱼精蛋白（Prm1）启动子的H3K9甲基化结合并调控基因表达，从而调节组蛋白-鱼精蛋白替换[12]。此外，H3K9甲基化在精子发生过程中的逆转座子抑制中具有重要功能，以维持精子DNA完整性[15]。综上所述，H3K9甲基化主要参与经原干细胞维持、减数分裂及组蛋白-鱼精蛋白替换。

2.5 H3K36在精子发生中的作用：H3K36三甲基化（H3K36me3）主要在基因上富集，是激活性修饰，主要分布在精母细胞和圆形精子细胞中[16]。SETD2也称为HYPB和KMT3A是H3K36me3的主要甲基化酶，主要在小鼠睾丸的粗线期精母细胞和圆形精子细胞中表达[16]。SETD2介导的H3K36me3是一个与转录耦联的组蛋白修饰标志，在转录激活的基因上富集。敲除Setd2导致粗线期精母细胞和圆形精细胞中H3K36me3完全消失，精子发生停滞在圆形精子阶段，顶体发生异常[16]。SETD2缺失影响精子形态发生相关蛋白的表达包括顶体结合蛋白1（ACRBP1）、转换蛋白、鱼精蛋白等，进而影响组蛋白-鱼精蛋白替换[14]。因此，H3k36me3主要在减数分裂后精细胞中起作用，参与精子形态发生和组蛋白-鱼精蛋白替换。

2.6 H3K79甲基化修饰在精子发生中的作用：H3K79的甲基化较为特异，只存在于长形精子细胞中，主要由甲基化酶DOT1L介导[12,17]。在果蝇中，Dot1l同源基因Grappa通过H3K79me直接参与组蛋白-鱼精蛋白替换。与果蝇中相似，小鼠Dot1l基因主要在减数分裂后在精细胞中表达，在染色质重组过程中，H3K79me3伴随着组蛋白H4的高乙酰化，H4的高乙酰化使染色质呈现松散状态，有利于组蛋白被替换蛋白替换，从而促进组蛋白-鱼精蛋白替换[12,17]。小鼠和人精子细胞H3K79me2/3主要发生在组蛋白替换期，在大鼠中，H3K79直接介导替换蛋白定位与染色质[12,17]。因此，H3K79甲基化是组蛋白-鱼精蛋白替换所必需的。

3 展 望

本文简要介绍了H3组蛋白赖氨酸位点的甲基化修饰在生精细胞中的分布和主要功能。不同的甲基化修饰呈现不同的生精细胞分布模式，行使不同的生物学功能，参与了生精过程的各个阶段。然而，现有组蛋白修饰功能证据主要来自于对甲基化酶的功能研究。甲基化酶的功能可以反映对应组蛋白修饰的作用，但是由于甲基化酶和组蛋白修饰不是一一对应的，因此，要明确组蛋白甲基化的具体功能，还需更直接的证据。未来随着技术的发展，利用高通量单细胞组蛋白修饰检测技术结合转录组及其他单细胞表观遗传组学分析，将可能为破解精子发生过程中的组蛋白修饰“密码”提供更充分的证据。另外，环境是影响生精功能的重要因素，比如吸烟、酗酒等。组蛋白修饰是这些因素的潜在作用靶点，但是具体作用机制也有待于深入研究。总之，揭示组蛋白修饰在精子发生中的作用和机制，有助于理解男性不育治病机制，提供潜在治疗靶点及理论支撑。