钙蛋白酶参与tau蛋白过度磷酸化和截断的机制研究进展

郭凯文，杨翠翠，张兰

首都医科大学宣武医院药学部，北京市神经药物工程技术研究中心，北京脑重大疾病研究院，神经变性病教育部重点实验室，北京市100053

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的特征性病理改变神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)是导致神经元退变的主要原因，可作为脑老化的标志，与AD 的认知功能障碍程度呈正相关[1]。微管相关蛋白tau能够产生许多异常翻译后修饰并聚集形成配对螺旋丝，NFTs 是配对螺旋丝进一步沉积形成的。其中，磷酸化和截断是tau蛋白翻译后修饰的主要形式，并且与AD 的发生和发展有着密切的关系[2-5]。钙蛋白酶(calpain)是一种细胞内蛋白酶家族，通过专一性蛋白水解酶作用发挥其功能，在细胞活动、信号传导、稳定细胞骨架结构等多个方面发挥作用，在AD 的发病过程中扮演重要角色[6-10]。最新研究表明[3,5]，钙蛋白酶能够调控tau 蛋白的截断以及异常过度磷酸化。明确钙蛋白酶与tau 蛋白异常翻译后修饰之间的关系，有助于为抗AD 的新药提供新的研究思路。本文对钙蛋白酶的生理活性以及其对tau 蛋白磷酸化、去磷酸化和截断等进行综述。

1 钙蛋白酶的结构

钙蛋白酶是在体内有广泛表达的保守的特异性依靠Ca2+激活的中性半胱氨酸蛋白酶[11]。自40多年前发现以来，钙蛋白酶家族的成员已经与多种疾病的病理状况相关，研究者们也对它们越来越关注。钙蛋白酶家族共有15 个成员，它们大多数作为mRNA 被鉴定，有一些具有组织特异性[12-15]。引起研究者广泛关注的有μ-calpain 和m-calpain，即在Ca2+浓度为μmol/L 和mmol/L级别下可以被激活的calpain 1和calpain 2[16]。

钙蛋白酶由一个80 kDa 催化亚基和一个28 kDa 调节亚基组成[17-18]。其中大亚基由Capn1和Capn2基因编码，具有4个结构域。小亚基由Capn4基因编码，具有2 个结构域。其中Capn4是calpain 1和calpain 2活性所需求的[19]。

2 钙蛋白酶的活性调节

钙蛋白酶的活性主要受细胞内Ca2+浓度的调节[20-21]。在未激活时，蛋白酶结构域II 的两个亚结构域(IIa 和IIb)是分开的。钙蛋白酶的激活主要有两个阶段。第一阶段，在Ca2+的存在下，这两个亚结构域结合，发生构象改变，这是激活钙蛋白酶和形成活性催化位点的必要条件。Ca2+与结构域III、IV 和VI中的EF-手性螺旋结合，从而将结构域II 与结构域III 分开。因此，在第一阶段结束时28 kDa 小亚基与80 kDa 大亚基解离。第二阶段，蛋白酶结构域II上的活性位点被重排，参与底物的水解过程[22]。钙蛋白酶的活性也可以通过它的水解片段来反映。

钙蛋白酶有超过100 种不同的底物，在正常生理条件下它们受到严格的控制，防止大量蛋白水解产生破坏性的后果。但是随着年龄的增长，尤其是患有糖尿病，肌营养不良以及认知障碍的患者，这种调节能力减弱，钙蛋白酶的活性升高[8]。

钙蛋白酶抑制剂(calpastatin,CS)是体内唯一的特异性钙蛋白酶家族抑制剂。在一项研究中calpain 2 的Ki值为10 nmol/L，证明CS对激活的钙蛋白酶的亲和力非常高[9]。在钙蛋白酶未激活的正常生理条件下，CS 的缺乏不会导致生殖、发育或行为异常。相反，红藻氨酸诱导的神经毒性会导致钙蛋白酶催化的蛋白水解水平上调或下调，CS 敲除(CS-KO)和CS 过表达小鼠会发生神经退行性变化，表明CS 在病理条件下可以抑制钙蛋白酶的活性[23]。

3 钙蛋白酶与tau蛋白

在AD 中出现的钙蛋白酶激活，会引起Ca2+稳态的紊乱，从而导致神经元死亡[24]。有研究发现[15]，在AD 患者脑脊液中，蛋白酶的表达和活性升高，钙蛋白酶的活化由可溶性β-淀粉样蛋白激活N-甲基-D-天冬氨酸受体介导。另有研究表明[25]，钙蛋白酶内源性抑制剂CS 能抑制神经细胞凋亡，对神经细胞起到一定的保护作用。

AD患者脑内tau蛋白磷酸化程度比普通人高3～4倍。tau蛋白磷酸化主要受磷酸激酶和磷酸酶的共同调节维持平衡，当这种平衡被打破，会造成tau 蛋白异常过度磷酸化，过度磷酸化的tau 蛋白聚集能力显著上升，失去原本的功能，以螺旋丝的形式聚集形成NFTs，造成神经元的变性损伤[26]。钙蛋白酶在tau 蛋白磷酸化和去磷酸化过程中起重要作用，并且对tau 蛋白的截断也有影响。

3.1 钙蛋白酶与tau蛋白磷酸化

糖原合成酶激酶3(gycogen synthase kinase 3,GSK3)是生物体内广泛分布的一种丝/苏氨酸磷酸激酶，已知有GSK3α、GSK3β 两种同工酶。其中，GSK3β 在细胞质、细胞核和线粒体内均有表达，参与调节多种细胞过程，如胚胎发育、凋亡、细胞分化、细胞增殖和细胞迁移等。GSK3β 是脑内诱导tau 蛋白过度磷酸化的主要磷酸激酶，可促进tau蛋白在多个与AD发生相关的位点磷酸化，例如Thr205、Thr212、Ser214、Thr217和Ser396/404 等[27-29]。SK3β 与AD 发病的主要病理机制有关，包括GSK3β 与Aβ 之间的相互作用[30]，可以磷酸化tau 蛋白[31]，可以与早老素和其他AD 蛋白相互作用，以及GSK3β对细胞凋亡的影响[32]。此外，GSK3β 参与记忆障碍的病变过程，抑制GSK3β 的活性，可改善学习和记忆。以上结果说明，GSK3β具有影响细胞存活，调节神经元可塑性、神经元分化和基因表达的重要作用，GSK3β 可能是神经退行性疾病如AD 发病机制的关键因素[30,33]。

calpain 1 和calpain 2 对GSK3β 的蛋白水解作用相似。通过calpain 1 截断GSK-3β 的C-末端(氨基酸382-433)显著增强GSK3β 对tau 蛋白磷酸化的活性，从而导致AD 患者脑中tau 蛋白过度磷酸化和神经原纤维变性。脑组织提取物与Ca2+共孵育发现，钙蛋白酶的激活可以使GSK3β 的抑制性结构域N 末端被切割，表明钙蛋白酶以某种方式促进GSK3 截断，这种方式可能会影响信号传导，并可能导致诸如AD等病理性疾病[34]。

相反，GSK3β不同位点的磷酸化可以影响钙蛋白酶介导的切割作用[35]。GSK3β在Ser9位点的磷酸化可以消除钙蛋白酶介导的C 末端和N 末端的切割，而GSK3β 在Ser389 位点的磷酸化仅抑制N末端切割[36]。

3.2 钙蛋白酶与tau蛋白去磷酸化

蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)是真核生物体内的丝氨酸和苏氨酸蛋白磷酸酶，能使蛋白质脱磷酸化，在tau 蛋白的脱磷酸化作用中，PP2A 占71%[8]。PP2A 是一种异源三聚体磷酸酶，由结构亚基、调节亚基和催化亚基三个部分构成。调节亚基有B/PR55、B'/PR61、B''/PR72、B'''/PR93 四种亚型，其分布具有组织特异性。在体内，PP2A 有1/3以核心酶形式存在，剩下2/3以全酶形式存在。

PP2A 表达的失调可能加速AD 的发展。AD 患者脑中PP2A 活性显著降低，在基因和蛋白质水平上，PP2A 的各种亚基(如PP2Ac)表达均减少[37-38]。神经元中tau 蛋白有多个丝氨酸和苏氨酸的磷酸化位点，它的过度磷酸化会影响微管的结合和解离，形成神经内NFTs，从而中断微管网络，引起认知障碍。

在降低tau 蛋白过度磷酸化的过程中，钙蛋白酶可以直接或间接作用于磷酸酯酶，主要表现为抑制PP2A 的表达。冈田酸处理和PP2A 催化亚基的沉默都可以减少饥饿诱导的FoxO3A 活化以及Capn4敲除的成纤维细胞的凋亡[39-40]。PP2A与Capn4敲除细胞中的Akt 更紧密地结合，表明PP2A 参与钙蛋白酶介导的FoxO调节。PP2A调节亚基B56α和γ是钙蛋白酶的体外底物，并且钙蛋白酶调节体内B56α 稳定性，calpain 1的激活可以导致PP2A 调节亚基B56α 的截断[41]。calpain 2 在Ca2+的存在下可以将调节亚基B''/PR72α2 和B''/PR130α1 水解成45～48 kDa 蛋白片段('PR45')。钙蛋白酶会减弱PR72 核心酶的相互作用，激活PP2A并显著增加其对聚阳离子的敏感性[42]。

3.3 钙蛋白酶与tau蛋白的截断

在体外，calpain 1 在正常和患病位点均有特异性切割，并且位点的选择是构象依赖性的，tau 蛋白单体主要在G323/G326 (正常位点)处切割，而tau 蛋白寡聚化增加AD 相关位点的切割[43]。tau 蛋白单体通过钙蛋白酶介导的tau 蛋白截断诱导神经变性，导致17 kDa神经毒性肽的积累和细胞凋亡[44]。

3.4 其他

在一些因素如兴奋性毒素、缺氧和Ca2+内流等的作用下，钙蛋白酶会被激活，被激活的钙蛋白酶可以将p35 剪切为p25，具有较高的磷酸化活性和神经毒性的细胞周期素依赖蛋白激酶5 (cyclin-dependent kinase 5,CDK5)-p25 复合物，可以增强tau蛋白在Ser202和Thr205位点的磷酸化[13]。因此钙蛋白酶的过度激活会导致NFTs的产生。

目前研究表明，在AD中钙蛋白酶对tau蛋白过度磷酸化和截断有直接或者间接的作用，钙蛋白酶有望成为治疗AD 的新思路。因此，针对钙蛋白酶对tau 蛋白磷酸化和截断的作用机制的研究可能为AD的药物治疗打开新局面。