miR-182表达和蛋白组学分析在未足月胎膜早破中的研究进展

鲍 雪 卢 丹

扬州大学临床医学院妇产科，江苏扬州 225001

胎膜早破（premature rupture of membranes，PROM）指临产前胎膜自然破裂，发生的孕龄越小，围生儿预后越差。未足月胎膜早破（preterm premature rupture of membranes，PPROM）是指孕龄＜37 周的PROM，可引起早产、胎盘早剥、羊水过少、脐带脱垂、胎儿窘迫和新生儿呼吸窘迫综合征等一系列母儿不良结局，使母儿感染率及围生儿病死率显著升高[1]。PROM 是多种因素影响的结果，其中，宫内感染是造成PROM 的最重要原因之一。Micro RNA（miR）是一类长19～25 NT的非编码小RNA，通过抑制翻译或降解mRNA 转录本的方式，从转录及转录后水平调控靶基因的表达[2]。其中，miR-182 是miR-183 簇（miR-183、miR-182 和miR-96）的成员，它是一个多功能分子，在多种疾病中发挥着重要的作用。miR-182 不仅在多种肿瘤细胞中异常表达，在宫内感染中也呈现了高表达[3]。近年来，蛋白组学分析已被用来作为研究胎儿状况和妊娠相关疾病的一个技术手段，从孕妇的血清、羊水及其他代谢产物中筛选出妊娠相关生物标志物，从而有效地监督妊娠，如胎儿非整倍体、早产、先兆子痫、羊膜内感染和胎儿应激等[4]。进一步探索miR-182 的表达及蛋白组学在PPROM 合并宫内感染中的意义，将为研究PPROM 合并宫内感染的预测提供新的思路。

1 PROM 的发病机制

PROM 是多种因素影响的结果，其发病机制尚未完全明确，目前主要集中于以下学说：①胎膜老化；②胎膜氧化应激失衡；③胎膜细胞凋亡；④胎膜蛋白酶系统/抗蛋白酶系统平衡失调。研究发现，宫内感染均参与了这4 种机制的发生发展，是造成PROM 的最重要原因之一[5]。

2 miR-182 概述

2.1 miR-182 的化学结构及生物功能

miRNA 是一类由19～22 个核苷酸组成的内源性小非编码RNA，可通过与靶基因mRNA 3′端非翻译区（3′-UTR）结合，抑制靶基因的翻译与mRNA 的稳定，而实现对靶基因的表达调控[6]，参与调节增殖、分化、凋亡、迁移、侵袭及细胞周期等细胞的多种生物学功能。miR-182 位于人类染色体7q32.2 的5kb 区域[3]，是miR-183 簇（miR-183、miR-182 和miR-96）的成员，位于人7 号染色体长臂31～34 位点，该区域的序列高度保守，参与细胞重要功能的调节[7]。

2.2 miR-182 在恶性肿瘤中的表达及意义

miR-183 簇在多种肿瘤组织中表达异常，在不同的恶性肿瘤中，各个成员的表达各有高低。在食管癌的研究中，miR-183/miR-182/miR-96 基因簇的相对表达量高于正常食管组织，其中miR-183 可能是食管鳞癌患者病情发展迅速、预后不良的影响因子之一[8]。而在黑素瘤中，以miR-182 表达升高显著，miR-183和miR-96 表达变化不甚明显，且在miR-182 的上游发现了TEAD1 的结合元件，提示TEAD1/miR-182 有望成为临床上治疗黑素瘤的新突破口[9]。

研究发现，miR-182 直接参与人类肿瘤的发生发展，但其作用机制尚不清楚，不同的肿瘤类型、部位及阶段，miR-182 的癌基因及抑癌基因的作用也不同[10]。miR-182 通常被认为是原癌基因在肿瘤的高表达，并促进肿瘤细胞增殖，如miR-182 在乳腺癌中高表达，并通过靶向调节叉头蛋白F2 促进乳腺癌细胞的增殖和迁移[11]。Spitschak 等[12]发现了miR-182 可通过重新排列癌基因激活NF-κB 因子和HES1/Notch1的监管途径促进癌症的入侵。Xu 等[13]还发现，miR-182 是长链非编码RNA 死亡相关蛋白kinase1（DAPK1）的靶基因，通过调控Ras 同源基因家族相关的蛋白激酶1 （ROCK-1）/Rho 的卷曲线圈及成员A（RhoA）信号通路，参与胰腺癌的侵袭转移。这些都是迄今为止miR-182 与肿瘤发生发展关系的最新研究的一部分，表明miR-182 与肿瘤的发生发展密切相关。

2.3 miR-182 在PROM 合并宫内感染时的表达及意义

Hanke 等[14]研究表明，miR-182 在膀胱上皮癌合并尿路感染中的表达水平升高； 在脓毒症中，miR-182 的表达上调[15]；在对猪传染性胃肠炎病毒感染相关猪源miRNA 进行的一项研究中，miR-182 的表达明显上调[16]。因此，miR-182 与感染的关系密切。陈骊珠等[4]研究表明，羊膜腔内感染可导致miR-182 的表达水平升高，不仅如此，miR-182 的高表达水平是早产儿脑损伤的独立危险因素。

目前，关于miR-182 在宫内感染中的作用机制尚未明确。Kaestle 等[17]对辅助T 细胞17 型（Th17）介导炎症与miRNA 的关系进行了研究，创建了一套小鼠T 辅助细胞分化的调控网络模型，发现多种miRNA 参与了Th17 介导的炎症。其中miR-212～132 和miR-182～183 簇在Th17 分化后显著上调，miR-182通过潜在地抑制Th1 和Treg 细胞的分化途径，在Th17 细胞功能中发挥了核心作用。Stittrich 等[18]通过一项研究表明miR-182 与辅助性T 淋巴细胞的活性密切相关，白介素-2（IL-2）诱导miR-182 表达水平升高，促进辅助性T 淋巴细胞的扩增。IL-2 是一种Th1 型细胞因子，当发生PROM 合并宫内感染时，IL-2的表达升高[19]，而诱导miR-182 表达升高，miR-182又可反过来抑制Th1 分化途径，实现一个动态循环。可见，miR-182 可能通过抑制Th1 分化途径来参与炎症反应。

3 蛋白组学分析概述

3.1 蛋白组学的研究目标及在恶性肿瘤中的应用

蛋白质组学是“一个细胞、一类组织或一种生物的基因组所表达的全部蛋白质”。现阶段，蛋白质组学的主要目标是通过功能和表达两个方面鉴定和识别潜在的生物标志物。蛋白质组学在细胞的增殖、分化、异常转化、肿瘤形成等方面有众多研究者进行了有力的探索，涉及到结肠癌、乳腺癌和前列腺癌等，发现了一批肿瘤相关蛋白，为肿瘤的早期诊断、药靶的发现、疗效判断和预后提供了重要的依据，此外，一些尚未探索标志物的肿瘤研究也取得了很大的进展，如S100A7 和CEACAM8 可以作为宫颈癌潜在的肿瘤标志物[20]。

3.2 蛋白组学在妊娠相关疾病中的应用

近年来，将蛋白质组学方法用于妊娠相关疾病的诊断，利用妊娠期妇女血清、羊水或其他代谢产物筛选妊娠相关生物标志物的研究取得了显著进展，如宫颈机能不全和妊娠期高血压等[21-22]。羊水中有丰富的数量和多种干细胞，常与胎儿接触，含有丰富的蛋白质，因此常用作为产前诊断的手段之一。随着对羊水蛋白质组学研究的深入，应用蛋白质组学技术在羊水中寻找新的生物学标志物已成为可能，并逐渐成为羊水研究的新方向。Liu 等[23]对7 例健康妊娠妇女的羊水样本进行了研究，通过免疫亲和性缺失的14 种高丰度蛋白，建立了一个广泛的正常妊娠妇女的羊水蛋白组，并分析了羊水蛋白组的个体间变异，为羊水蛋白组学分析及妊娠相关疾病生物标志物的发现提供了参考。

到目前为止，羊水中的几种蛋白已在临床上用作生物标志物，如人类绒毛膜促性腺激素β 链（HCGβ）、甲胎蛋白和抑制素A 应用于唐氏综合征的诊断，以及HCG-β 和抑制素A 应用于13-三体综合征和18-三体综合征的诊断等[24]。另外，对妊娠其他并发症的潜在生物标志物的研究也取得了一定的进展。Hallingstrom 等[25]对妊娠中期羊水的质谱蛋白组学分析，表明C-反应蛋白（CRP）可能是自发早产的潜在标志物，但通过ELISA 实验没有验证到这种预测潜能，具体还有待于进一步的实验研究。

3.3 蛋白组学在PROM 合并宫内感染中的研究现状

目前认为宫内感染可直接导致PROM 发生，当发生亚临床感染时，也会导致组织引起炎症。2004年，Gravett 等[26]对早产合并亚临床羊膜腔内感染孕妇进行了羊水蛋白质组学研究，发现最主要的蛋白质分子量分布为10b12 kDa，早产合并亚临床羊膜腔感染者为高表达，而单纯早产及正常足月分娩者高表达者极少，并确认了两种差异表达的蛋白：钙粒蛋白B 和胰岛素生长因子结合蛋白1，同时出现在母体外周血中也检测到了这两种蛋白，表明其有助于羊膜腔内感染的诊断。在妊娠期，外泌体作为旁分泌通道的媒介参与胚胎发生、胎盘发育及妊娠维持[27]。最近，Dixon 等[28]对羊水的外泌体进行了一项研究，发现了一个有趣的结果，在自发性早产、PPROM、正常临产和未临产这四组的外泌体在大小、形状、特征上及蛋白质数量上没有任何主要差异，却发现了大量差异表达的蛋白，这些差异表达的蛋白代表了炎症和免疫反应。

4 小结与展望

目前临床上常用的检测宫内感染的指标有白细胞计数、中性粒细胞百分比、CRP、降钙素原、阴道清洁度和B 族链球菌等。这些指标都不具有特异性，正常妊娠妇女的检测值也会比正常人偏高，难以判断孕妇是否发生宫内感染，尤其是当发生亚临床宫内感染时，为决定下一步临床措施带来了一定的困难。因此，对感染指标进行监测就显得尤为重要。miR-182 在羊膜腔内感染时的高表达，羊水中差异表达的特异蛋白质，均为PPROM 合并宫内感染的特异生物标志物的检测提供了一个新的思路。