抗构象表位桥粒芯蛋白抗体和乙酰胆碱受体抗体滴度与寻常型天疱疮病情活动度的相关性研究

李志量 张寒梅 向睿宇 荆可 冯素英

中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院皮肤科 江苏省皮肤病与性病学重点实验室，南京210042

寻常型天疱疮（pemphigus vulgaris，PV）是一种以血清中存在桥粒芯蛋白（desmoglein，Dsg）抗体为特征的自身免疫性水疱病。根据受累部位，可分为皮肤黏膜型和黏膜型天疱疮，单纯皮肤受累的PV较少见。黏膜型PV血清中通常仅有Dsg3抗体，皮肤黏膜型PV 血清中通常同时存在Dsg1 和Dsg3 抗体［1-2］。部分研究表明［3-6］，Dsg抗体滴度可一定程度上反映PV 患者病情严重程度和病情活动度。Dsg抗体可分为抗构象表位抗体和抗线状表位抗体，其中抗构象表位抗体有致病性［7］。传统Dsg抗体检测方法检测的是抗构象表位抗体和抗线状表位抗体总量。近年来有文献报道［8］，通过改良的酶联免疫吸附试验（ELISA）可以检测出抗构象表位Dsg抗体滴度，可能比传统方法更能反映病情变化。也有研究发现，胆碱能途径在天疱疮的发病中可能发挥作用，并且部分患者血清中可以检测到乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor antibody，AChR）抗体［9］。本研究检测了PV 患者血清中抗Dsg 抗体及抗Dsg 构象表位抗体的滴度和AChR 抗体滴度，以探究PV血清抗体滴度与病情严重程度和病情活动度的相关性。

对象与方法

一、对象

中国医学科学院皮肤病医院于2012—2015 年收治的24例PV患者，男13例，女11例。所有入选病例符合以下标准：①皮肤和/或黏膜出现松弛性水疱，尼氏征阳性；②组织病理可见棘层松解细胞；③直接免疫荧光可见角质形成细胞间IgG 和/或C3 沉积；④Dsg1 和（或）Dsg3 抗体ELISA 检测值＞20 U/ml。同时符合①、②、③或者④时诊断为PV。按照天疱疮病情活动度分为活动期和稳定期。活动期指患者发病初次就诊，未系统使用糖皮质激素及细胞毒性药物，就诊前3天有新发水疱或糜烂面；稳定期指至少2周内没有新发的红斑和水疱，原有的水疱和糜烂面完全消失，糖皮质激素用量相当于醋酸泼尼松≤20 mg/d。本文24 例PV 患者均有皮肤和口腔黏膜受累，首次就诊时处于活动期。根据患者病情严重程度，使用不同剂量糖皮质激素（部分患者同时使用环磷酰胺、麦考酚酯或硫唑嘌呤等免疫抑制剂）治疗。共有20 例患者完成随访，均为稳定期，天疱疮疾病面积指数（pemphigus disease area index，PDAI）评分均≤3，糖皮质激素用量相当于≤20 mg/d 醋酸泼尼松，稳定期患者距首次就诊间隔时间为半年至2 年。本研究通过中国医学科学院皮肤病医院伦理委员会批准（批准号：2010临审09号），所有患者均签署知情同意书。

二、方法

1.PDAI 评分及血清标本采集：24 例活动期患者首次就诊时采集血清标本，评估PDAI。20 例患者随访至稳定期时再次采集血清标本，评估PDAI。

2.ELISA检测Dsg1、Dsg3抗体：将PV患者血清稀释（1∶101）后，按照ELISA试剂盒（日本株式会社医学生物学研究所）说明书操作。在波长450 nm处读取吸光度（A值），以2个孔的均值作为结果，按照说明书公式计算抗体滴度。当滴度值＞150 U/ml时，稀释血清，重新检测，并按照稀释倍数计算真实滴度。

3. 改良ELSIA 检测Dsg1、Dsg3 抗构象表位抗体［7，10］：乙二胺四乙酸（EDTA）具有破坏抗原构象表位的作用，用EDTA 处理包被抗原的ELISA 孔板30 min 后，再进行后续ELISA 检测，可以只检测线状表位的抗体滴度，用传统方法测得的抗体滴度减去抗线性表位的抗体滴度，得到的结果即为抗构象表位抗体滴度。

4.ELISA 法检测患者血清中AChR 抗体：按照ELISA 试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）说明书操作，设2个复孔，取平均值。阳性判定标准：试验孔A值＞2.1×阴性对照A值。

结 果

一、Dsg1抗体及抗构象表位Dsg1抗体与PV患者PDAI的关系

首次就诊时，活动期患者的Dsg1 抗体滴度（611.4 ± 136.8）与 抗 构 象 表 位Dsg1 抗 体 滴 度（585.5 ± 134.7）差异无统计学意义（t = 0.13，P =0.89）。活动期患者的Dsg1抗体滴度及抗构象表位Dsg1 抗体滴度与PDAI 评分均呈正相关（r = 0.54、0.54，均P ＜0.01）。20 例稳定期患者的Dsg1 抗体与抗构象表位Dsg1抗体滴度与首次就诊时比较均明显下降（抗体检测阴性或滴度＜活动期时的20%）。

二、Dsg3抗体及抗构象表位Dsg3抗体与PV患者PDAI的关系

首次就诊时，活动期患者的Dsg3 抗体滴度（708.6 ± 130.7）高于抗构象表位Dsg3 抗体滴度（297.2 ± 54.4），差异有统计学意义（t = 2.90，P ＜0.01）。活动期Dsg3 抗体滴度与PDAI 评分无相关性（r=0.11，P=0.62），抗构象表位Dsg3 抗体滴度与PDAI评分呈正相关（r=0.53，P ＜0.01）。

20 例稳定期患者抗构象表位Dsg3 抗体滴度（119.9 ± 40.7）低于活动期（297.2 ± 54.4），差异有统计学意义（t=2.52，P ＜0.05）。20 例稳定期患者血清中Dsg3 抗体滴度与活动期相比，7 例明显下降，13 例仍存在较高滴度Dsg3 抗体（抗体检测滴度＞活动期的20%），这13 例患者活动期时的PDAI 评分（38.26 ± 3.36）高于另外7 例（29.29 ±3.12，t=1.74，P ＜0.05），且这13例患者中有6例在稳定期抗构象表位Dsg3抗体滴度明显下降。

三、AChR抗体与PV患者病情的关系

活动期患者中有6 例AChR 抗体阳性，稳定期患者均为阴性。在上述13例稳定期血清中仍存在较高滴度Dsg3抗体的患者中，5例在活动期可检测到AChR 抗体；上述7例稳定期血清中Dsg3抗体明显下降的患者中，仅1 例在活动期可检测到AChR抗体（P=0.30）。

讨 论

本研究采用传统的ELISA 与改良ELISA 检测PV 患者血清中的Dsg 抗体与抗线性表位的Dsg 抗体。改良的ELISA 通过EDTA 破坏致病性的构象表位，可直接检测非致病性线性表位，再与传统的ELISA 比较，可得到致病性构象表位的抗体滴度，理论上更能反映病情严重程度和病情变化。

本研究中，两种方法检测的活动期患者Dsg1抗体与抗构象表位抗体差异无统计学意义，提示PV患者血清中Dsg1抗体绝大部分为有致病性的抗构象表位抗体；活动期患者的Dsg1 抗体滴度及抗构象表位Dsg1抗体滴度与PDAI评分均呈正相关，这也提示两种方法测得的Dsg1抗体及抗构象表位Dsg1抗体滴度都可以反映病情的严重程度。在稳定期患者中，两种方法测得的Dsg1 抗体及抗构象表位Dsg1 抗体滴度都显著下降，提示两种Dsg1 抗体滴度都可以反映病情变化。本文两种方法检测活动期患者Dsg3 抗体时，Dsg3 抗体滴度显著高于抗构象表位抗体，且活动期患者的Dsg3 抗体滴度与PDAI评分无相关性，抗构象表位Dsg3抗体滴度与PDAI 评分呈正相关，提示患者血清中存在一定数量的非致病性线状表位Dsg3 抗体，而采用改良的ELISA 检测的抗构象表位Dsg3抗体滴度更能反映病情的严重程度和病情的活动性。在临床工作中，结合改良ELISA 检测的Dsg3抗体滴度，可能更有助于反映患者病情活动度。

以往部分研究提示，除Dsg抗体外，AChR抗体在PV 发病中也可能发挥一定的致病作用［11-12］，但不同的研究中，AChR抗体的检出率有差别［3，9］。本研究中，24 例活动期患者中也只有6 例AChR 抗体阳性，而这6例患在病情稳定后，抗体滴度都转阴，提示AChR 抗体滴度也可一定程度上反映病情的活动情况。值得注意的是，稳定期患者中，7 例患者Dsg3 抗体滴度较活动期明显下降，13 例患者血清中仍存在较高滴度的Dsg3 抗体，部分患者滴度甚至高于病情活动期。而这13例中，5例在活动期可检测到AChR 抗体，7 例中，仅1 例可检测到AChR抗体，提示稳定期患者Dsg3抗体滴度较高的患者，检测到AChR 抗体的概率更高，但由于样本量较少，还需更多的样本验证。

本文中，这种PV 患者病情的减轻与传统Dsg3抗体滴度降低不一致的情况在以往的研究中［13-14］并不少见，造成这种不一致性的原因有3 种，①部分患者血清中存在着非致病性的抗线性表位的Dsg3 抗体；②部分患者血清中可能存在着有致病性的AChR抗体；③部分患者血清抗Dsg3抗体亚型中，非致病性IgG1亚型比例高，从而导致了Dsg3抗体滴度与病情变化不一致。我们的研究中，有13例患者表现出了病情变化与传统Dsg3抗体滴度不一致的情况，其中6例病情变化与抗构象表位Dsg3抗体有关，5 例在活动期可检测到AChR 抗体，另外2 例不一致的原因不明确，可能属于上述第3 种情况，但需要通过对抗体亚型的滴度进行检测以进一步证实。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突