SRT1720鞘内给药对乳腺癌骨转移大鼠疼痛的影响及其机制

郝苗苗，余良主，秦方，谢敏，朱海丽

(湖北科技学院药学院，湖北咸宁437100)

病理性疼痛是一种慢性疾病，其临床表现为痛觉过敏、自发性疼痛以及痛觉超敏等[1]，严重影响患者生活质量，甚至可导致患者丧失生活自理能力。肿瘤细胞可激活外周伤害性感受器，并将疼痛信号上行传导至脊髓和脊髓上中枢，导致胶质细胞活化、内源性阿片系统功能抑制、神经元活化、突触重构等，致使中枢敏化，从而产生病理性疼痛[2]。SRT1720属于喹喔啉甲酰胺盐酸盐，分子式为C25H23N7OS，相对分子质量为506.02，是一种选择性人源沉默信息调节因子2同源物1(SIRT1)激活剂，可通过氨基末端催化区的变构位点结合到SIRT1上，从而发挥作用[3]。2018年6～10月，本研究观察了SRT1720鞘内给药对乳腺癌骨转移大鼠疼痛的影响，并探讨其相关机制，以期为慢性病理性疼痛的机制研究及小分子镇痛药物开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：雌性SD大鼠18只购于湖北省实验动物中心，体质量160～200 g，6～8周龄。细胞：大鼠乳腺癌MRMT-1细胞购自广州吉妮欧生物科技有限公司。主要试剂：二甲基亚砜(DMSO)、SRT1720、蛋白酶抑制剂cocktail均购自美国Sigma公司，加强型RIPA lysis buffer、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、HRP标记山羊抗兔lgG(H+L，A0208)均购自上海碧云天生物技术有限公司，RPMI1640培养基、胰蛋白酶、青霉素+链霉素混合液均购自美国HyClone公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，anti-SIRT1(A0127)、anti-rabbit-β-actin(A1978)均购自中国ABclonal公司，anti-rabbit-pSer47-SIRT1(PA5-17391)购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 模型建立及分组处理 将18只雌性SD大鼠适应性喂养1周，随机分为假手术组、模型组和SRT1720组，每组6只。模型组和SRT1720组均建立乳腺癌骨转移疼痛模型，方法如下[4]：将大鼠乳腺癌MRMT-1细胞置于含10% FBS、1% L-谷氨酰胺、2% 青霉素+链霉素的RPMI1640培养基中进行培养，收集细胞并重悬于HBSS缓冲液。模型组和SRT1720组采用戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹膜麻醉，剃毛消毒；胫骨上半部分开口，微量注射器将10 μL MRMT-1细胞悬液(含3×105个细胞)注射到左侧胫骨髓腔内，骨蜡封口。假手术组注射相同体积HBSS缓冲液。将SRT1720溶解在DMSO中，使用前用生理盐水按体积比1∶1进行稀释，调整浓度为20 mmol/L。建模12 d后，SRT1720组剃除注射部位毛发并进行注射部位皮肤表面消毒，用无菌微量注射器于L5和L6脊椎棘突间隙垂直进针，当出现空洞感时证明注射器已进入蛛网膜下腔，将注射器由垂直缓慢倾斜至45°；根据体质量单次注射SRT1720 1.0 mg/kg，注射完毕后缓慢取出微量注射器，轻轻按压注射部位1～2 min[5]。模型组与假手术组注射相同体积DMSO+生理盐水(体积比为1∶1)。

1.3 疼痛情况观察 采用50%缩足阈值(PWT)评价。各组给药后0、1、3、5、7、24 h，根据up-down法检测50% PWT。方法如下：将动物放置于行为测试笼内，当其安静状态时，用Von Frey纤维(0.4～26 g)对大鼠后足底正中部进行垂直剌激，刺激时纤维稍微弯曲2～3 s即可，每相邻的两次刺激之间间隔2 min。安静状态下动物在受到刺激后出现舔足或者抬足等行为视为阳性反应，反之则为阴性反应。当出现阳性反应时，需用相邻较低一级力度的Von Frey纤维进行刺激；当出现阴性反应时，需用相邻较高一级力度的Von Frey纤维进行刺激。在出现与前一次测试反应不一致的测试结果时开始记录(连同反应出现变化前的一次测试在内)，记录6次数据后结束检测[6]。50% PWT(g)=(10[Xf+Kδ])/10 000，Xf为本次行为学测试中使用的最后一个Von Frey纤维的阶数，K为痛觉阈矫正系数(可查表获得)，δ为相邻不同纤维刺激之间的差异，即0.224[7]。

1.4 脊髓组织SIRT1、p-SIRT1表达检测 采用Western blotting法。各组给药后24 h，给予戊巴比妥钠50 mg/kg处死，分离整个脊柱。用眼科剪从中间分离脊柱，暴露脊髓，用解剖剪剥离脊膜，得到完整的脊髓，分离腰段脊髓。加入含有酶抑制剂的RIPA裂解液匀浆组织，4 ℃条件下10 000 r/min离心15 min；取上清，加入1/3体积的4×上样缓冲液，沸水浴加热10 min，BCA蛋白分析试剂盒检测上清中的蛋白质浓度。SDS-PAGE分离蛋白质样品，电转移到PVDF膜，5%脱脂奶粉在室温下封闭1 h，TBS-T洗膜5 min×3次。分别加入SIRT1、p-SIRT1一抗(稀释比例均为1∶1 000)，4 ℃条件下孵育过夜。加入二抗，室温孵育1 h。TBS-T缓冲液洗膜3次，Universal HoodⅡ凝胶成像系统扫描观察，Image J软件分析条带灰度值。以β-actin为内参，以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值计算SIRT1、p-SIRT1蛋白相对表达量，并计算p-SIRT1/SIRT1。

1.5 脊髓组织TNF-α表达检测 采用ELISA法。取各组大鼠腰段脊髓组织，使用含有蛋白酶抑制剂混合物的PBS缓冲液(pH 7.4)进行匀浆，将不同浓度标准品、样品各100 μL加入孔中，37 ℃条件下反应90 min。弃液后按每孔100 μL依次加入抗TNF-α抗体工作液，37 ℃条件下反应60 min。洗涤后加入100 μL ABC工作液，37 ℃条件下反应30 min。洗涤后加入90 μL TMB显色液，37 ℃条件下反应25～30 min，加入TMB终止液。使用酶标仪检测450 nm波长处的OD值。

2 结果

2.1 各组不同时间点50% PWT比较 与假手术组比较，模型组给药后0、1、3、5、7、24 h的50% PWT均降低，SRT1720组给药后0、24 h的50% PWT均降低(P均<0.05)；与模型组同时间点比较，SRT1720组给药后1、3、5、7、24 h的50% PWT均升高(P均<0.05)。见表1。

表1 各组不同时间点50% PWT比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.2 各组脊髓组织SIRT1、p-SIRT1、TNF-α表达及p-SIRT1/SIRT1比较 与假手术组比较，模型组脊髓组织SIRT1、p-SIRT表达均降低，TNF-α表达升高(P均<0.05)；与模型组比较，SRT1720组脊髓组织SIRT1、p-SIRT1表达及p-SIRT1/SIRT1均升高，TNF-α表达降低(P均<0.05)。见表2。

表2 各组脊髓组织SIRT1、p-SIRT1、TNF-α表达比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

病理性疼痛会引发外周敏化和中枢敏化，外周敏化的特征为伤害性感受器激活，导致痛觉阈值降低；中枢敏化表现为脊髓胶质细胞激活、神经兴奋性和突触功能增加等[7]。基于乳腺癌的发病率和转移率均较高[8]，本研究将大鼠乳腺癌细胞MRMT-1注入大鼠胫骨骨髓腔内，利用雌性大鼠构建乳腺癌骨转移疼痛模型。结果显示，模型组、SRT1720组给药后0 h的50% PWT均明显低于假手术组，表明建模成功；模型组给药后1、3、5、7、24 h的50% PWT均低于假手术组，表明乳腺癌骨转移大鼠的机械痛敏增加；SRT1720组给药后1、3、5、7、24 h的50% PWT均高于模型组，表明SRT1720鞘内给药可降低乳腺癌骨转移大鼠的机械痛敏、减轻其疼痛。

SIRT1是一种NAD+依赖型的去乙酰化酶，其激动剂可明显改善鼠类痛觉行为，而SIRT1沉默可逆转这种镇痛效果[9,10]。SIRT1能够催化组蛋白底物和非组蛋白底物的乙酰赖氨酸，并进行去乙酰化反应，其中乙酰赖氨酸修饰指将乙酰基添加到目标蛋白内部赖氨酸残基的ε-NH3上；赖氨酸去乙酰化酶将赖氨酸上的乙酰基团移除，使蛋白质发生去乙酰化修饰[11]。SIRT1通过其去乙酰化酶活性在染色质重塑、基因调控、代谢、癌症等相关疾病发生及延缓衰老等方面发挥重要作用[12]。SIRT1-Ser47是SIRT1酶活的活化位点，该位点的磷酸化水平表示SIRT1酶活，其磷酸化水平上调表明SIRT1活性升高，并可激活SIRT1靶基因表达[13]。本研究以p-SIRT1/SIRT1表示SIRT1的激活程度，即活化的SIRT1在总SIRT1中所占的比例。结果显示，模型组脊髓组织SIRT1、p-SIRT1蛋白相对表达量均低于假手术组，表明其SIRT1表达和活性均下降；SRT1720组脊髓组织SIRT1、p-SIRT1蛋白相对表达量均高于模型组，表明SRT1720鞘内给药可显著激活SIRT1活性。

SIRT1可通过多种途径参与痛觉的调控。SIRT1可调控NF-κB p65亚单位转录后的乙酰化修饰水平，上调NF-κB活性，影响炎症反应的发生[14]。在神经病理性疼痛模型大鼠中，脊髓SIRT1可下调代谢性谷氨酸受体(mGluR1/5)表达，影响膜受体及离子通道功能，参与突触可塑性并影响突触传递效能[15]。在吗啡耐受痛觉模型大鼠中，激活SIRT1可逆转已上调的NMDA受体(NR1和NR2B)表达，抑制突触后信号传导及炎症反应[16]。在乳腺癌骨转移疼痛模型大鼠背根神经节中，SIRT1通过细胞自噬途径调节酸离子通道表达，抑制H+介导的疼痛信号[3]。在糖尿病引发神经痛模型中，激活SIRT1可降低突触结构相关蛋白突触后致密体蛋白95和生长相关蛋白43表达，抑制已增强的结构突触可塑性[17]。

在中枢神经系统中，星形胶质细胞在结构上与突触密切相关，有助于神经元回路建立和重组、神经元活动调节和突触结构维持[18]。星形胶质细胞在各种疼痛相关的损伤状态下被激活，并且可持续很长时间[19]。活化的星形胶质细胞可释放多种炎症介质如TNF-α，以增强和延长持续性疼痛[20]。本研究结果显示，模型组脊髓组织TNF-α表达均高于假手术组和SRT1720组，而假手术组和SRT1720组脊髓组织TNF-α表达无明显差异；这表明TNF-α参与了乳腺癌骨转移大鼠的疼痛过程，而SRT1720鞘内给药可显著减轻TNF-α引起的炎性反应。但是，TNF-α是否为SIRT1参与痛觉的调控途径之一，以及SIRT1与TNF-α的相互作用仍需进一步探讨。

综上所述，SRT1720鞘内给药可减轻乳腺癌骨转移大鼠疼痛，其机制可能与激活脊髓SIRT1活性及抑制炎症反应有关。