AGPS基因沉默对神经胶质瘤细胞lncRNA、mRNA表达谱的影响及意义

崔菀真，朱彧，岳伟

(1天津中医药大学，天津301617；2天津市环湖医院 天津市脑血管与神经变性重点实验室)

神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，也是最常见的颅内恶性肿瘤，占颅内原发肿瘤的50%～60%。近年来，分子靶向成为神经胶质瘤临床研究的热点[1]。烷基甘油酮磷酸合酶(AGPS)是醚酯合成的关键酶，对癌细胞的生成具有重要作用[2]。长链非编码RNA(lncRNA)是指转录本长度大于200个核苷酸的RNA序列，因缺少完整的开放阅读框而无法编码蛋白质，但lncRNA可通过多种生物学过程调控基因表达，在细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等方面均具有重要作用[3]。mRNA指信使RNA，即携带遗传信息的RNA，最终能编码出相应的蛋白质。2019年1～6月，本研究通过基因芯片技术获得神经胶质瘤细胞的基因全序列，采用生物信息学方法分析AGPS对神经胶质瘤细胞lncRNA、mRNA表达谱的影响并预测其功能，为研究AGPS促进神经胶质瘤细胞增殖的分子机制提供理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 神经胶质瘤U251细胞购自天津赛尔生物技术有限公司。两种沉默率不同的慢病毒shR-AGPS-1、shR-AGPS-2均购自美国Sigma公司，阴性对照慢病毒、羊抗鼠IgG抗体、β-Tublin抗体、羊抗兔IgG抗体均购自天津赛尔生物技术有限公司，总RNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，lncRNA+mRNA二合一芯片、末端标记和杂交试剂盒均购自美国Gene Chip公司，全转录组扩增试剂盒购自美国Thermo Fisher公司，抗AGPS抗体购自美国Santa公司，Western LightningTM化学发光试剂盒购自美国Perkin Elmer公司。

1.2 细胞培养及慢病毒转染 将U251细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，37 ℃条件下CO2恒温培养箱中进行培养。转染前1 d按2×105/孔接种于6孔板，每孔加2 mL培养基，至细胞融合率达60%～80%。将shR-AGPS-1、shR-AGPS-2和阴性对照慢病毒分别置于含聚凝胺的DMEM培养基中，将U251细胞分为shR-AGPS-1组、shR-AGPS-2组和对照组，分别加入上述培养基。稳定转染24 h，更换为不含聚凝胺的DMEM完全培养液2 mL，置于孵箱内37 ℃继续培养72 h。

1.3 单克隆细胞筛选及细胞形态观察 各组细胞转染72 h后加嘌呤霉素进行筛选，初始嘌呤霉素浓度设置为1 μg/mL，每3 d更换1次筛选液继续进行筛选。将细胞进行稀释，制备密度为1×103/mL的单细胞悬液，以0.2 mL/孔接种于96孔板的第1排；从第1排吸取0.1 mL细胞悬液接种于第2排，一直到第8排，筛选获得单克隆细胞。将单克隆细胞在完全培养基中继续培养，获得单克隆细胞系。倒置显微镜下观察三组细胞形态及增殖情况。

1.4 AGPS蛋白表达检测 采用Western blotting法。将三组筛选后的细胞接种于6孔板中，24 h后加入蛋白裂解液RIPA 300 μL/孔，4 ℃条件下摇动30 min，将细胞裂解液移至1.5 mL离心管。配置10% SDS-PAGE分离胶，取50 μg蛋白样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳，至目的蛋白有效分离，湿法将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上形成印迹。用Blotto溶液室温摇动封闭2 h，将膜按蛋白的印迹位置剪开，分别加入抗AGPS抗体(1∶1 000)和兔抗原β-Tublin一抗(1∶1 000)，4 ℃条件下摇动过夜。 TBST溶液摇动漂洗5 min，共4次。加入二抗，抗AGPS抗体(1∶1 000)使用HRP标记羊抗鼠IgG抗体，内参β-Tublin(1∶1 000)使用HRP标记羊抗兔IgG抗体。室温条件下孵育1.5 h，TBST溶液摇动漂洗5 min，共4次。将膜置于Western LightningTM化学发光剂中，30 s后进行显影、定影处理，采用Image J软件分析各组条带灰度值。AGPS蛋白相对表达量以AGPS条带灰度值与内参β-Tublin条带灰度值的比值表示。

1.5 lncRNA及其共表达mRNA表达谱建立及差异表达筛选 取三组筛选后的细胞，通过总RNA提取试剂盒提取总RNA，全转录组扩增试剂盒进行文库构建和扩增，应用基因芯片技术检测lncRNA及其共表达mRNA表达谱。使用R软件包将原始数据进行标准化处理，以对照组作为标准，对shR-AGPS-1组、shR-AGPS-2组差异表达的lncRNA及其共表达mRNA进行筛选，筛选标准为|FC|>1.2、P<0.05、误判率<0.05，FC>0表示表达上调、FC<0表示表达下调。

1.6 lncRNA共表达mRNA的功能预测 应用Gene Ontology数据库对lncRNA共表达的mRNA进行基因本体(GO)富集分析，对差异基因进行功能注释。通过京都基因与基因组大百科全书(KEGG)对lncRNA共表达的mRNA进行富集分析，得到差异基因参与的信号通路，并对信号通路进行一级及二级分类。

1.7 lncRNA共表达mRNA信号通路作用网络、全局信号转导网络、lncRNA对通路调控网络的构建 应用Cytoscape软件，根据KEGG信号转导通路间相互作用关系,构建lncRNA共表达mRNA信号通路作用网络；分析信号通路作用网络对应的mRNA，根据基因、蛋白质、化合物之间的作用关系,构建全局信号转导网络；根据lncRNA和靶基因的显著性通路，利用lncRNA和靶基因通路的属性，构建lncRNA对通路的调控网络，根据节点周围连线计算节点的特征值和节点度。

2 结果

2.1 三组细胞形态及增殖情况比较 与对照组比较，shR-AGPS-1组和shR-AGPS-2组细胞均出现团缩以及增殖抑制等变化，且shR-AGPS-2组变化更加显著。见图1。

2.2 三组细胞AGPS蛋白表达比较 shR-AGPS-1组、shR-AGPS-2组和对照组细胞AGPS蛋白相对表达量分别为0.44±0.09、0.19±0.09、1.00±0.13，两组间比较P均<0.05。见图2。

图1 三组细胞形态及增殖情况观察

注：A为对照组,B为shR-AGPS-1组,C为shR-AGPS-2组。

图2三组细胞AGPS蛋白表达情况(Western blotting法)

2.3 lncRNA差异表达筛选结果 与对照组比较，shR-AGPS-1组73个lncRNA表达上调、107个lncRNA表达下调，shR-AGPS-2组266个lncRNA表达上调、233个lncRNA表达下调。

shR-AGPS-1组筛选出差异倍数最大的前20个lncRNA分别为LINC00837、CTC-436K13.3、AK129941、MIR548AA2、linc-FCGR1B-7、CR626472、ERI3-IT1、linc-AKR1B10-2、AF344193、AK098597、LINC01079、XXbac-B33L19.4、ENST-00000551732、AF086041、linc-LOC388630-3、linc_luo_384、AC-008440.10、linc_luo_541、linc-SEC23B、linc-CNTN3-3，FC分别为1.79、-1.76、-1.64、-1.58、-1.57、1.49、1.48、1.44、1.44、-1.42、1.41、1.41、1.40、-1.40、-1.40、-1.40、1.40、1.39、-1.39、-1.39。

shR-AGPS-2组筛选出差异倍数最大的前20个lncRNA分别为LINC00837、CR618823、MIR548AA2、LINC00973、FENDRR、linc_luo_1251、LINC00263、linc-JAK1-1、BC013423、linc-COL1A2-2、linc_luo_1846、linc-WDR7-7、AC003092.1、uc001tkz.2、linc_luo_1223、AL110176、LUCAT1、CTC-436K13.3、linc-U2AF1-1、uc003flo.2，FC分别为2.95、-2.59、-2.58、-2.42、2.21、-2.11、-2.01、-1.95、-1.88、-1.87、-1.85、-1.83、-1.82、-1.81、-1.79、-1.78、-1.76、-1.76、1.71、-1.70。

2.4 lncRNA共表达mRNA差异表达筛选结果 与对照组比较，shR-AGPS-1组13个mRNA表达上调、63个mRNA表达下调，shR-AGPS-2组61个mRNA表达上调、111个mRNA表达下调。

shR-AGPS-1组筛选出差异倍数最大的前20个mRNA分别为CXCL8、OR2J2、SLC7A11、THBS1、APOH、KIR2DL5B、HMGA2、LTB、PSAT1、BLID、ZNF404、SLC38A1、CXCL8、PRPS1、IGHD3-16、ZNF404、HIST1H3I、C3orf17、CHML、IGFBP1，FC分别为-2.1、1.84、-1.81、1.58、-1.56、1.53、-1.53、1.5、-1.49、-1.45、-1.44、-1.43、-1.43、1.42、-1.42、-1.42、1.41、-1.41、-1.41、-1.39。

shR-AGPS-2组筛选出差异倍数最大的前20个mRNA分别为CXCL8、AGPS、IGFBP1、APOH、CXCL8、SLC7A11、SLC38A1、THBS1、PTGS2、TREM1、SCD、CHML、OGFRL1、IL7R、IGFBP3、SEL1L3、HMGA2、PSAT1、DOCK10、ROS1，FC分别为-6.94、-4.53、-4.22、-3.22、-2.7、-2.67、-2.45、2.31、-2.29、-2.28、-2.21、-2.2、-2.16、-2.15、-2.12、-2.09、-2.06、-2.05、-2.03、-2.03。

2.5 lncRNA 共表达mRNA的功能预测结果 GO富集分析结果显示，lncRNA共表达mRNA注释的显著性功能主要包括细胞对缺氧的反应、细胞外基质、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)介导的蛋白反应、细胞黏附、血管生成正向调节等。KEGG富集分析结果显示，lncRNA共表达mRNA显著富集的信号通路包括晚期糖基化终末产物(AGE)/晚期糖基化终末产物受体 (RAGE)信号通路、类风湿关节炎、TNF信号通路、内质网蛋白质合成、疟疾等。见图3。一级分类结果显示，差异基因显著富集的信号通路主要涉及人类疾病、环境信息传递以及生物体系统等过程；二级分类结果显示，差异基因显著富集的信号通路主要涉及感染性疾病的发生、信号转导、免疫系统、肿瘤发生等过程。

图3 lncRNA共表达mRNA的GO和KEGG富集分析结果

2.6 lncRNA共表达mRNA信号通路作用网络和全局信号转导网络构建结果 lncRNA共表达mRNA信号通路作用网络包括37个节点和158条连线，连线较多的节点为磷脂酰肌醇三激酶(PI3K)信号通路、Toll样受体信号通路、补体系统、黏着斑以及血管内皮生长因子(VEGF)信号通路等。全局信号转导网络包括75个节点和164条连线，连线较多的节点为表皮生长因子受体(EGFR)、整合素α11蛋白(ITGA11)、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)等。

2.7 lncRNA对通路的调控网络构建结果 该网络包括136个节点，其中包含94个lncRNA以及42个信号转导通路，节点之间共有979条连线。特征值最高的lncRNA为AK093732，该lncRNA处于网络的枢纽地位，对多个信号通路和样本状态有重要的调控价值。特征值分析结果显示，差异lncRNA所调控的核心信号转导通路即细胞因子与受体相互作用。筛选出特征值最高的前20个lncRNA分别为AK093732、LINC01384、FENDRR、uc011bsz.1、linc-PTPRN2、linc-U2AF1-1、RP11-221N13.3、BC042023、BC043357、linc_luo_1251、linc_luo_35、linc_luo_1223、LINC00973、linc-ANKRD20A1-20、linc-NBPF15-1、uc003flo.2、linc-ANKRD20A1-14、linc-DUSP10-7、linc-FOXB2-3、linc-WISP3-2，节点度分别是34、27、25、25、24、24、24、23、23、23、23、22、22、22、22、22、21、21、21、21。特征值最高的前20个信号转导通路分别为细胞因子及其受体相互作用、PI3K/AKT信号通路、细胞黏附分子、AGE/RAGE信号通路、p53信号通路、类风湿关节炎、NF-κB信号通路、单纯疱疹感染、疟疾、TNF信号通路、胰高血糖素信号通路、黏着斑、HTLVI型感染、甲型流感、膀胱癌、南美锥虫病、癌症的中心碳代谢、Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路、黑热病，节点度分别是49、45、40、36、36、36、34、33、33、30、29、28、28、27、26、26、25、24、22、22。

3 讨论

AGPS是一种对醚类脂质形成至关重要的酶，AGPS可将酰基甘油-3-磷酸转化为烷基甘油-3-磷酸，是生成所有醚类脂质的必要步骤[4]。癌细胞以不同于正常细胞的方式代谢脂质[5,6]，肿瘤组织中醚类脂质含量高于正常组织[7]，并且在高侵袭性肿瘤中醚类脂质表达水平增高。因此，改变AGPS表达水平能够使侵袭性较弱的癌细胞也产生侵袭性和致瘤性[2]。本研究对神经胶质瘤U251细胞进行AGPS沉默，结果发现与对照组相比，shR-AGPS-1组、shR-AGPS-2组均出现了不同程度的团缩及增殖抑制，且shR-AGPS-2组团缩及增殖抑制更明显、AGPS表达更低，说明AGPS对于维持肿瘤细胞形态和致病特性具有重要作用。

lncRNA以往被认为是转录过程中的副产物、基因转录组的噪音，但是现有研究证实lncRNA在RNA水平上对细胞生长、分化以及多能干细胞维护、癌症发生过程均具有重要的调节作用[8,9]。本研究筛选了与神经胶质瘤相关的lncRNA,并利用生物信息学方法分析lncRNA参与调控的生物学功能和信号转导通路，构建lncRNA对信号转导通路的调控网络，得到处于枢纽地位的lncRNA。LINC01384是本研究得到的枢纽之一，是肿瘤抑制因子FOXA2邻近的lncRNA。Liang及其同事将该lncRNA命名为LNCNEF，该研究团队发现LNCNEF是从上游FOXA2基因转录而来，可以顺式调控FOXA2表达，LNCNEF通过抑制Wnt/β-catenin轴而激活FOXA2表达，从而抑制体内癌细胞转移[10]。FENDRR是一种对血管发育具有重要作用的内皮细胞基因，FENDRR过表达可促进人脑微血管内皮细胞凋亡[11～15]。研究证实，FENDRR对人类肺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤具有重要的调控作用，其可通过抑制HuR/MDR1轴降低非小细胞肺癌细胞的干细胞特性，通过抑制SOX4蛋白表达而延缓结肠癌进展[16～19]。目前，FENDRR在神经胶质瘤方面的研究尚无文献报道。本研究中AGPS沉默后细胞FENDRR表达较对照组显著提高，说明FENDRR表达与神经胶质瘤的恶性程度呈负相关，但是FENDRR在神经胶质瘤细胞中的作用及相关机制仍需进一步研究。一项关于反式白藜芦醇的研究发现，在服用神经保护制剂反式白藜芦醇的小鼠大脑中，其linc-PTPRN2表达较服用标准饮食的小鼠显著下调，推测反式白藜芦醇对中枢神经系统的保护作用可能与其降低不同基因表达有关[20]。本研究发现，在通路调控网络中处于枢纽地位之一的linc-PTPRN2通过调控共表达的细胞间黏附分子-1，间接参与调控细胞黏附分子、AGE/RAGE、NF-κB、TNF等信号转导通路。但是,关于linc-PTPRN2在这些信号通路中的调控机制仍需进一步研究。本研究信号通路作用网络和全局信号转导网络中连线较多的节点为PI3K信号通路、Toll样受体信号通路、VEGF信号通路等，在lncRNA对通路的调控网络中AK093732处于网络调控的枢纽地位，细胞因子与受体相互作用为lncRNA调控的核心通路。

综上所述，沉默AGPS表达可通过引起神经胶质瘤细胞中相关lncRNA及其共表达mRNA的差异表达而影响细胞增殖和凋亡，其中PI3K、Toll样受体及VEGF信号通路可能是其主要靶点通路。本研究筛选了与神经胶质瘤相关的lncRNA和mRNA，这些差异表达的lncRNA及其共表达mRNA在神经胶质瘤的发生、发展和转移中发挥重要的生物学作用，为进一步研究神经胶质瘤的发生机制奠定基础。同时本研究建立了lncRNA对信号转导通路的调控网络，为后续更进一步研究神经胶质瘤中关键lncRNA在信号通路中的调控作用机制提供了方向。