血必净注射液对老年重症急性胰腺炎患者外周血单核细胞NLRP3炎性小体表达的影响

夏炳杰 强占荣 李桂鲜 秦振梅 骆雪萍

(桂林医学院第二附属医院重症医学科，广西 桂林 541199)

有研究报道，有15%～25%的急性胰腺炎可进展为重症急性胰腺炎(SAP)，其死亡率高达20%～50%，特别是对于老年患者，死亡率可进一步升高〔1，2〕。研究显示，炎症通路的激活与SAP的发生、发展密切相关，相关炎性细胞因子如白细胞介素(IL)-8、γ干扰素及肿瘤坏死因子(TNF)-α等水平与其病情严重程度密切相关，同时可有效的评估预后〔3〕。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NLRP3)炎性小体是免疫炎症反应的重要组成部分，参与了众多炎症性疾病如器官缺血再灌注损伤、慢性阻塞性肺疾病及动脉粥样硬化等疾病的发生、发展过程〔4～6〕。研究显示，NLRP3炎性小体可协同NF-κB的激活，促进及放大急性胰腺炎的炎症瀑布效应，引起大量促炎细胞因子的合成与分泌，而抑制NLRP3炎性小体，可显著降低炎症反应，阻止急性胰腺炎的进展〔7〕。目前，中医药已广泛运用于急性胰腺炎的临床治疗，如血必净注射液在调节免疫、抑制炎症反应方面发挥重要作用，可显著提高急性胰腺炎患者临床疗效〔8〕。本研究探讨血必净注射液对老年SAP患者NLRP3炎性小体表达的影响。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取2016年1月至2018年12月于桂林医学院第二附属医院就诊住院的老年SAP患者100例作为研究对象，其中男58例，女42例，年龄61～80岁，中位年龄70.5岁。致病原因：胆囊及胆管结石(40例)；暴饮暴食及酒精性(31例)；高脂血症(10例)；药物性(7例)；自身免疫性(6例)及其他(6例)；纳入标准：患者均符合SAP诊断与治疗指南〔9〕；年龄≥60岁。排除标准：合并恶性肿瘤、其他部位严重感染的患者；合并严重肝肾功能不全的患者；存在其他自身免疫性疾病和免疫缺陷的患者；对研究药物过敏的患者。根据治疗方法的不同，将上述患者按随机数字表法，分为对照组(50例)和观察组(50例)。两组间在性别、年龄、病程、致病原因等方面无统计学差异(P>0.05)。本研究获得了桂林医学院第二附属医院伦理委员会的批准并征得了患者家属书面知情同意。

1.2主要设备及试剂 主要设备：荧光定量PCR仪(美国Bio-rad公司)；主要试剂：人淋巴细胞分离液(美国Sigma公司)；反转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒(Takara公司)；Western印迹相关试剂盒,如二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)配制试剂盒(上海碧云天公司)；人血清IL-1β和IL-18酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(中国博士德公司)；内毒素ELISA检测试剂盒(南京GenScript公司)；抗NLRP3、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-1单克隆抗体(美国Abcam公司)；抗甘油醛-2-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(美国Santa公司)。

1.3治疗方法 入院后对照组患者给予严格禁食禁水，留置胃管，给予补液用以维持机体水、电解质和酸碱平衡，抑制胰酶分泌，提供静脉营养并给予持续血液灌流等治疗。观察组在对照组治疗的基础上加用血必净注射液(天津红日药物公司，批准文号：国药准字Z20040033，规格10 ml/支)，每次100 ml，每天2次，连用1 w。

1.4观察指标

1.4.1一般临床资料采集 记录患者一般临床资料如年龄、性别、基础疾病等，同时记录患者治疗前后修正CT严重指数评分(MCTSI)、Ranson评分及APACHEⅡ评分。

1.4.2分离外周血单个核细胞(PBMCs) 取两组患者治疗前后静脉血5 ml，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，按照1∶1比例与人外周血淋巴细胞分离液混匀后离心，分离PBMCs，将1 ml Trizol加入PBMCs中混匀后备用。

1.4.3qRT-PCR检测炎性小体NLRP3及Caspase-1 mRNA水平 运用Trizol法提取各组治疗前后PBMCs总RNA，测定RNA浓度，然后按反转录试剂盒说明书进行反转录。其中qPCR引物由上海生工公司设计合成，NLRP3上游引物：5′-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3′，下游引物：5′-GCTTCAGTCCCACACAGA-3′；Caspase-1上游引物：5′-ATCGCTTTCTGCTCTTCCAC-3′，下游引物：5′-TCCTCCACATCACAGGAACA-3′；内参GAPDH上游引物：5′-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3′，下游引物：5′-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3′。依据TaKaRa公司提供的荧光定量PCR试剂盒说明书建立20 μl反应体系，反应条件：预变性，95℃120 s，95℃5 s，60℃30 s，40个循环；溶解曲线：95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s，60℃15 s。结果分析：以GAPDH为内参，计算各组相应基因的ΔΔCT值。以目的基因的量为定量结果进行统计学分析。

1.4.4免疫印迹法检测PBMCs NLRP3、Caspase-1的蛋白表达水平 提取两组治疗前后人PBMCs总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取50 μg蛋白于10%PAGE分离后，转移置硝基纤维素膜，给予5%脱脂牛奶封闭2 h，分别孵育抗NLRP3抗体(1∶400)、Caspase-1抗体(1∶300)及抗GAPDH抗体(1∶400)，4℃避光孵育过夜。次日取出膜，给予避光室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)，采用凝胶成像系统测定蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，并计算目的条带与GAPDH灰度比值。

1.4.5外周血细胞因子(IL-1β、IL-18)的检测 取各组清晨空腹静脉血4 ml，离心后收集上清，采用ELISA法测定不同组间外周血IL-1β、IL-18、内毒素水平，具体操作依据试剂盒说明书进行。

1.4.6临床疗效的观察 观察两组患者治疗后临床疗效，其临床疗效分为痊愈、显效、有效及无效，具体见中华医学会颁布的SAP诊治指南〔9〕。

1.5统计学分析 采用SPSS19.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1两组治疗前后相关病情严重程度评分比较 与治疗前比较，两组治疗后MCTSI评分、Ranson评分及APACHEⅡ评分均显著降低(P<0.05)；而与对照组治疗后比较，观察组治疗后上述评分降低程度更显著(P<0.05)，见表1。

表1 两组治疗前后相关病情严重程度评分比较分)

与治疗前比较：1)P<0.05；与对照组治疗后比较：2)P<0.05；下表同

2.2两组治疗前后外周血单核细胞NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平比较 两组治疗后外周血单核细胞NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平均显著低于治疗前(P<0.05)；与对照组治疗后比较，观察组治疗后上述指标明显降低(P<0.05)，见图1，表2。

1～4：对照组治疗前、观察组治疗前、对照组治疗后、观察组治疗后图1 Western印迹检测各组NLRP3、Caspase-1蛋白表达

表2 两组治疗前后外周血NLRP3、Caspase-1蛋白及mRNA表达水平比较

与治疗前比较:1)P<0.05；与对照组治疗后比较:2)P<0.05

2.3两组患者治疗前后炎性因子水平比较 与治疗前比较，两组治疗后外周血IL-1β、IL-18及内毒素水平均明显降低(P<0.05)；而观察组治疗后上述指标降低程度较对照组治疗后更明显(P<0.05)，见表3。

表3 两组治疗前后炎性因子水平比较

2.4两组临床疗效比较 观察组临床总有效率显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 两组临床疗效比较〔n(%),n=50〕

与对照组比较:1)P<0.05

3 讨 论

SAP常并发多器官功能障碍，易出现肺、肾等功能受损，表现为急性呼吸窘迫综合征和急性肾衰竭，造成病情进展迅速，死亡率极高。大量研究显示，炎症反应的激活在SAP的发生及其他部位器官进行性损伤过程中起重要作用，SAP可引起大量促炎因子的激活，导致炎症反应瀑布效应及级联放大，造成组织器官损伤〔10〕。SAP患者早期即可出现IL-6及TNF-α水平升高，而给予抗感染治疗后，其炎性水平可明显降低，并且与病情严重程度及预后的改善密切相关〔11〕。因此，在早期常规治疗的基础上，给予阻断炎症级联反应，调节机体免疫平衡，对于SAP的治疗至关重要。

调节免疫，改善机体炎症状态，对于改善SAP患者病情，提高治疗效果有重要意义。相关研究已证实，由免疫炎性体NLRP3介导的炎症反应在多种疾病如器官缺血再灌注损伤、脓毒症、恶性肿瘤等的发生、发展过程中，发挥重要作用〔4，12，13〕。NLRP3是由胞质内多种蛋白质组成的复合体，其含有凋亡相关微粒蛋白、Caspase-1等，是天然免疫系统的重要组成部分。当NLRP3受外在刺激被激活时，活化的Caspase-1随后激活IL-1β和IL-18，产生炎症级联反应。相关研究显示，NLRP3可促进炎症性疾病如慢性阻塞性肺疾病、糖尿病肾病及动脉粥样硬化等的进展，同时其可作为潜在的治疗靶点，如动物实验表明，抑制NLRP3激活可显著降低糖尿病肾病的炎症反应，改善肾功能及预后〔5，7，14〕。血必净注射液是由多种中药提取而成，具有调节机体免疫，抑制炎症反应，减轻重要组织器官损伤的作用，已在SAP患者的治疗中，得到了广泛运用〔15〕。血必净注射液对SAP治疗作用的具体机制，同时对老年SAP患者NLRP3炎性小体的表达如何，目前尚不清楚。本研究中，对于老年SAP患者，在常规治疗的基础上，给予血必净注射液，其可显著改善患者临床治疗效果，主要表现为患者病情严重程度评分，包括MCTSI评分、Ranson评分及APACHEⅡ评分均较对照组显著降低。动物实验表明，急性胰腺损伤时，体内炎性通路可显著激活，其NLRP3炎性小体及下游Caspase-1 mRNA、IL-1β及IL-18水平均显著升高〔16〕。以往研究显示，炎症可促进细胞凋亡，而细胞凋亡是引起组织器官功能障碍的主要机制之一，在细胞凋亡通路中，Caspase-1是重要的剪切酶，抑制Caspase-1活性可显著减轻细胞凋亡〔17〕。本研究结果显示，血必净注射液可显著降低NLRP3炎性小体及下游相关炎性通路的激活，其可能与改善患者临床症状及提高治疗效果密切相关。NLRP3炎性小体是炎症反应发起及进一步放大的重要环节，有研究显示，抑制NLRP3炎性小体活性及表达，可显著降低体内炎性细胞因子水平，从而降低炎症反应〔18〕。针对老年SAP患者，血必净注射液可能通过降低NLRP3炎性小体水平，抑制炎性通路激活，提高临床疗效。