肠道菌群调节肠道MicroRNA治疗骨质疏松症

白浩 孙海飚 韩晓强 张子楠 李光明 薛建刚 张锦涛 许磊 冯志国

1.山西医科大学第一临床学院，山西 太原 030001 2.山西医科大学第一医院骨科，山西 太原 030001

1 骨质疏松症概述

全身骨骼系统是一个处于动态更新的系统，经历着不断重塑的过程，参与该过程的细胞包括成骨细胞和破骨细胞，当动态平衡被打破，趋向于破骨细胞活性相对增强即会导致骨质疏松症(osteoporosis，OP)[1]。OP的特点是骨量降低，骨组织细胞赖以生存的微环境恶化，最终导致骨折风险增加。OP可根据雌激素缺乏或病理变化分为原发性和继发性两种[2]。有报道显示在美国OP影响了大约5 400万人，其中50岁及以上的人群中，三分之一的女性和五分之一的男性会因OP而骨折，预计到2025年，因骨质疏松性骨折造成的经济负担将超过250亿美元[3]。

OP治疗目的是防止骨质丢失，改善骨重建不平衡。目前，除了通过健康生活方式干预，还可通过补充维生素D和钙剂预防治疗OP[4]。对于存在高骨折风险的患者，则应及早进行药物干预治疗。但是有报道显示，目前的抗OP药物对上消化道存在刺激，严重者会引发颌骨骨坏死、骨肉瘤、乳腺癌、不典型转子下骨折等严重不良事件[5]。这推动着人们不断探索和寻找预防、治疗OP的新方案。

2 MicroRNA

2.1MicroRNA概述

MicroRNA(miRNA)是由真核细胞核中内含子或外显子DNA转录而来的，在被输出到细胞质之前，转录形成的初级前体miRNA(pri-miRNA)被加工成含70个碱基对茎环结构前体miRNA。随后pre-miRNA进入细胞质，由内切酶Dicer将其裂解成小分子的双链RNA片断，然后将单链加载到沉默复合物中(RISC)，形成成熟的miRNA复合物[6]。miRNA能够结合信使RNA(mRNA)的3’非翻译区从而抑制mRNA的翻译过程[7]。研究发现miRNA可能由体内一系列细胞分泌，如肠上皮细胞、免疫细胞、干细胞、血细胞或脂肪细胞，在人体生理或病理状态下发挥重要作用[8]。miRNA 不仅在细胞内液可以检测到，且在人的多种体液中，如血液、尿液、唾液及脑脊液中都可检测到[9]。因此，这使得将miRNA作为疾病诊断依据及治疗靶点成为可能。

2.2miRNA与OP

miRNA具有转录后调节因子的作用，可参与调节骨形成和吸收中不同的细胞过程[10]。miRNA可通过抑制成骨抑制因子或介导成骨细胞分化，促进间充质干细胞向成骨细胞分化，具有促进骨形成作用[11]。由于miRNA发挥作用具有严格的核苷酸配对原则，因此当单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNPs)位于或接近miRNA与mRNA相互识别的区域，即可能破坏miRNA-mRNA的相互作用，最终导致骨代谢异常和OP的发生[12]。与I型前肽(P1NP)和血清C端肽胶原蛋白(CTX)相比，miRNA在体液中往往具有更高的可测性和更强的稳定性[13]。因此，可以看出miRNA不仅是骨代谢过程中的调节因子也可以作为骨代谢标志物进行检测。据报道，7个miRNA家族的遗传变异可能影响骨质代谢过程，包括miR-27a、miR-124、miR-125、miR-146a、miR-149、miR-196a2和miR-2861。最近的研究进一步揭示了几个新的多态性家族(miR-140-5p、miR-149、miR-3679、miR-4274、miR-433、miR-499和pri-miR-34b/c)，这些多态性家族也与OP的发生过程密切相关[14-15]。可见miRNA与骨形成密切相关，并且可用于检测评估骨代谢情况。随着相关检测技术的不断完善，将有更多具有调节骨代谢作用的miRNAs被发现。

3 肠道菌群与益生菌

3.1肠道菌群与益生菌概述

肠道菌群(gut microbiota，GM)是宿主健康所必需的，在宿主新陈代谢、营养物质吸收利用、病原体抵抗和免疫功能调节等方面发挥着至关重要的作用。GM表达的基因组数量远约为人类基因组数量的100倍[16]。GM中也含有益生菌，其中乳酸菌、肠球菌、大肠杆菌、双歧杆菌作为益生菌已被广泛应用于日常生活中[17]。近年来发现益生菌可能具有预防和治疗疾病潜力。

3.2益生菌与OP

益生菌可通过调节肠道内pH值、分泌抗菌肽、增加黏液分泌、调节宿主肠道免疫系统、重构GM结构进而改善肠道上皮组织通透性[18]。Britton等[19]利用12周大Balb / c小鼠制造卵巢切除(ovariectomized，OVX)模型，给予罗伊氏乳杆菌ATCC 6475干预治疗后，发现经干预治疗后的OVX小鼠与对照组小鼠相比骨密度(bone mineral density，BMD)显著增加，完全不受骨量丢失的影响。进一步研究认为罗伊氏乳杆菌对骨的保护作用是由于其抑制破骨细胞中mRNA水平下降，进而减少RANKL和TRAP5的表达实现的。可见益生菌可以防治OP，同时在骨代谢基因转录后表达环节进行调控。Collins 等[20]发现罗伊氏乳杆菌6475能够系统性地抑制肠道和骨髓中促炎细胞因子和促破骨细胞因子的基因表达，减轻肠道炎症，进而促进钙通过肠道屏障的转运。Campbell 等[21]发现双歧杆菌属细菌通过产生短链脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFAs)，可降低肠道pH值，进而增加矿物质的吸收，防治OP。此外，双歧杆菌被证明还能通过减少氧化应激进而减少NF-κB基因表达，预防雌激素缺乏大鼠骨质流失[22]。可见益生菌可以通过调节宿主肠道黏膜免疫细胞中炎症因子转录后表达水平，进而改善离子通道通透性干预OP。总之，益生菌可能通过调节基因转录后表达，减轻肠道炎症，改善离子通道状态，最终实现预防骨量丢失作用。

4 GM和miRNA相互作用关系

有研究发现，无菌(germ-free，GF)小鼠和无特定病原体(specific pathogen free，SPF)小鼠的盲肠组织中有16个miRNA表达存在差异[23]，将SPF级小鼠粪便中提取出的GM移植入无菌小鼠肠道后，可以观察到无菌小鼠的回肠和结肠内有9个miRNA的表达发生了显著变化，进而导致其下游目的基因调控产物发生变化，而这些目的基因的表达产物与肠道屏障和免疫调节功能有关[24]。可见GM可以调节肠上皮细胞、肠黏膜免疫细胞内miRNA水平，最终改变肠上皮通透性和黏膜免疫状态。为研究miRNA是否参与了微生物介导的宿主基因表达调控，Dalmasso等[24]使用GF小鼠与SPF小鼠的微菌群进行克隆，通过DNA微阵列基因表达谱分析，发现miR-665的上调导致ATP binding cassette subfamily C member3 (Abcc3)基因显著下调。可见GM可以通过调节miRNA水平进而影响宿主靶基因转录后表达。

目前国内外研究主要关注于GM与OP、miRNA与OP，但关于GM调节肠道miRNA治疗OP 鲜有报道。虽然目前尚未有报道明确提出肠道内具有调节OP的miRNA，但是已有明确报道通过调节GM可以调节肠道miRNA表达，进而缓解炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)，而IBD与OP有着密切的关系。因此通过上述分析我们有理由提出GM很可能通过调节肠上皮细胞、黏膜免疫细胞内miRNA，进而调控与肠道屏障通透性、黏膜免疫状态相关靶基因表达，最终治疗OP。

5 IBD与OP

随着人们认识深入，OP已被描述为慢性炎症性疾病。患有IBD、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、脊椎关节炎、慢性阻塞性肺病等全身炎性免疫变态疾病的患者大多都长期接受糖皮质激素治疗，而糖皮质激素对骨骼有有害影响。炎症本身是造成OP的另一个主要决定因素[25]。Ashcroft等[26]发现白介素2(IL-2)缺乏的小鼠自体免疫模型中，小鼠骨量减少与CD4自身反应性T细胞的去调节和过度活化密切相关。NF-κB受体激活剂配体(RANKL)的增加可导致骨量丢失，通过调节RANKL-RANK与外源性重组骨保护蛋白(Fc-OPG)的相互作用，可以逆转骨骼异常。可以看出，IBD患者由于GM失调促发肠道炎症免疫变态反应，是OP发生的中心环节。因此，控制肠道炎症状态使IBD减轻，是治疗IBD所致OP的关键。

5.1GM通过调节肠道miRNA缓解IBD，间接治疗OP

Lindsa等[27]借助超高通量测序技术对小鼠模型空肠和结肠黏膜的miRNA进行了定量测定，发现Dicer敲除小鼠中有许多肠屏障基因在转录后受到调控，它们可能依赖于miRNA。Xue等[28]观察发现在SPF小鼠，肠道微生物群抑制宿主肠道上皮细胞和树突状细胞(dendritic cell，DC)中miR-10a的表达，有助于维持肠道免疫稳态。Xue等[29]在另一个大肠杆菌感染的小鼠模型肠道中，发现miR-107在上皮细胞和CD11c+髓样细胞(包括炎症肠道中的树突状细胞和巨噬细胞)中显著降低，从而下调IL - 6、IFN-γ、TNF-α。结合前面所述GM对于肠道miRNA有调控作用，我们有理由推测GM可以通过调节肠道与IBD相关的miRNA表达水平，进而调控肠上皮屏障功能及肠黏膜免疫状态缓解IBD，最终减轻由IBD导致的OP。

5.2GM通过调节肠道miRNA直接治疗OP

IBD和OP具有相同的miRNA作为宿主基因调控的中介，调控肠道通透性、免疫变态反应及成骨细胞和破骨细胞的活性。Xue等[29]研究发现，miR-10a在GF小鼠肠道内高表达，但在脾脏中表达水平很低，说明miR-10a主要在肠道内表达。结肠炎小鼠炎症性肠组织表达低水平miR-10a和高水平IL-12/IL-23p40。微生物群通过TLR-TLR配体相互作用，以myd88依赖的方式下调DC中 miR-10a的表达，促使DC产生大量IL-12/IL-23p40，大量炎症因子激发IBD的发生，从而肠道内稳态被破坏。Hou等[30]使用miR-10a 转染小鼠成骨细胞前细胞系MC3T3-E1a，研究发现miR-10a 可以阻遏Wnt /β-catenin 信号通路。Wnt /β-catenin 信号通路在成骨细胞的增殖、分化以及骨组织的再生中起着重要作用，该通路的激活可以促进骨组织的再生。Koukos等[31]发现miR-124在溃疡性结肠炎(UC)患者结肠组织中特异性下调，直接靶向结肠组织中STAT3磷酸化水平升高。Xue等[29]发现在关节炎的小鼠模型中，用 pre-miR-124治疗，可使破骨细胞的数量明显减少。NFATc1 是破骨细胞分化的一个关键因素，miR-124 能够直接作用于 NFATc1，抑制破骨细胞的分化，缓解关节炎的发展。可以看出肠道中也具有与骨代谢调控有关的miRNA，结合前面所述GM对于肠道miRNA有调控作用，我们有理由推测GM通过调节肠道与骨代谢相关的miRNA治疗OP。

综合以上所述，GM一方面可以通过调节肠道IBD相关miRNA减轻肠道炎症，缓解IBD进而间接治疗OP；另一方面可以直接调节肠道高表达的与OP和IBD同时相关的miRNA直接治疗OP。通过检测靶向调节肠道免疫应答途径中的关键信号分子；肠黏膜及上皮屏障功能；肠道炎症因子水平[32]可以判断GM究竟是通过调节肠道miRNA减轻肠道炎症状态间接治疗OP，还是通过直接调节肠道高表达的与OP和IBD同时相关的miRNA直接治疗OP。

6 总结与展望

总之，目前研究尚局限于GM干预OP、miRNA干预OP，很少关注GM可能通过调节肠道内miRNA治疗OP。通过分析可以看出GM可能通过调节肠道内miRNA水平影响宿主肠道基因转录后产物，进而影响肠上皮通道和肠黏膜免疫应答，最终达到治疗OP的目的。虽然目前尚无法得知究竟是哪种GM甚至是益生菌可以靶向调控肠道miRNA水平的变化，也无法得知具体参与该过程的肠道miRNA，但随着肠道菌群检测技术和高通量测序技术的发展，这一切将变的可行，或许能够为OP 的预防和治疗提供新的思路。