木通皂苷D促进糖皮质激素环境下小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化

张志达 沈耿杨 任辉 余翔 尚奇 黄锦菁 招文华 余佩沅 詹玫琦 梁德 杨志东 江晓兵*

1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405 2. 广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科，广东 广州 510405 3. 广州中医药大学岭南医学研究中心，广东 广州 510405

糖皮质激素(glucocorticoids，GCs)具有良好的抗炎、抗过敏、抑制免疫等作用，广泛应用于临床。但长期、超生理剂量摄入GCs可引发骨质疏松。GCs摄入是导致继发性骨质疏松最常见的因素[1]。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)可向成骨细胞、脂肪细胞等多方向分化，直接影响骨形成，调节骨量。GCs可抑制BMSC成骨分化、促进BMSCs成脂分化[2]。木通皂苷D(akebia saponin D，ASD)又称川续断皂苷VI，是川续断的主要活性成分[3]，研究显示ASD可促进BMSCs向成骨细胞分化[4]。BMP/Smad信号通路可调控成骨细胞的全部过程，其功能障碍可引起骨形成减少[5]。因此，本研究拟通过研究ASD对在GC环境下小鼠BMSC成骨分化的影响，为今后ASD在防治GIOP中的开发应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1细胞提取、培养与传代

8周龄健康C57BL/6小鼠脱颈法处死，70%酒精浸泡消毒5 min，切开髋关节周围的皮肤，用无菌的解剖剪刀和镊子从每只小鼠后肢分离出股骨和胫骨，去除皮肤、肌肉肌腱等软组织，将干净的骨头放在培养皿中。无菌剪刀剪除每根骨的两端，暴露骨髓腔，用1 mL注射器抽取冲洗培养基(49 mL α-MEM+1 mL FBS+0.5 mL P/S)冲出骨髓至15 mL离心管。室温下以1 000 r/min离心10 min，弃上清液，室温下将细胞悬浮于5 mL红细胞裂解缓冲液中5 min。用10 mL冲洗培养基再洗细胞1次并离心，用1 mL冲洗培养基重新悬浮细胞，计算细胞数量。细胞至于体积分数5% CO2、37 ℃、湿度75%的培养箱中恒温培养。72 h更换生长培养基(45 mL α-MEM+5 mL FBS+0.5 mL P/S)，之后每3 d更换1次培养基，待细胞80%～90%融合后传代，用胰蛋白酶消化细胞至大部分细胞重新悬浮，再加入培养基终止胰蛋白酶消化作用，1 000 r/min离心5 min；弃上清，用培养基重悬细胞后移至新的培养瓶中培养。传至第3代后进行成骨诱导。

1.2主要仪器、试剂及药物

研究型正置荧光生物显微镜(OLYPUS公司，日本)、T100梯度PCR仪、CFX96实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)，全波长酶标仪(Thermo，美国)、电泳仪(BIO-RAD，美国)、垂直板电泳装置(BIO-RAD，美国)、Tanon-2500R型全自动数码凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)等。

α-MEM培养基(Gibco公司，美国)，胎牛血清(FBS；Gibco公司，美国)，胰蛋白酶(Gibco公司，美国)，C57BL/6小鼠BMSCs成骨诱导分化培养基[α-MEM基础上含10% FBS+1% Penicillin-Streptomycin双抗+50 μg/mL抗坏血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸钠；赛业(苏州)生物科技有限公司，中国]，碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒(Roche公司，瑞士)，茜素红S(Roche公司，瑞士)，Trizol (Invitrogen公司，美国)，RNA提取试剂盒、反转录试剂盒PrimeScriptTM RT Master Mix、荧光定量SYBR© Premix ExTaq TMⅡ试剂盒(TAKARA，日本)，Runx2、OCN、Smad1、Smad5引物(Life公司，美国)，抗-Smad1/5/8抗体(1∶500；CST公司，美国)，抗磷酸化Smad1/5(pSmad1/5)抗体(1∶500；CST公司，美国)；醋酸地塞米松片(Sigma公司，美国)；ASD(Sigma公司，美国)等。

1.3实验方法

1.3.1药物干预：细胞分别用成骨诱导培养基(OBI)、OBI+DEXA(0.1 μmol/L)、OBI+DEXA(0.1 μmol/L)+ASD(10 μmol/L)干预，分别进行碱性磷酸酶(ALP)活性测定，茜素红染色检测成骨早期矿化情况；定量实时荧光PCR(qRT-PCR)检测成骨因子骨钙素(osteocalcin, OCN)、Runx2以及Smad信号通路Smad1、Smad5的表达，Western blot检测Smad信号通路Smad1/5磷酸化水平和Smad1/5/8总蛋白水平。

1.3.2ALP活性检测：药物干预5 d后收集细胞培养液上清，测定ALP活性，具体步骤方法参照试剂盒操作。

1.3.3茜素红染色检测成骨矿化情况：药物干预14 d后取出1块12孔板，吸去培养基，PBS(1×)清洗2遍，加入95%戊二醛溶液固定，4°过夜，40 mmol/L茜素红染色15 min，水洗3次，PBS(1×)洗涤15 min后，拍照洗脱茜素红测OD值。

图2 不同干预诱导成骨矿化情况Fig.2 Osteogenic mineralization in different treatments

1.3.4qRT-PCR检测续断皂苷对DEXA环境下成骨因子mRNA表达的影响：药物干预5 d后，用异硫氰酸胍(Trizol)法提取细胞总RNA，RNA酶消化并反转录，qRT-PCR反应引物：Runx2：GACCAGTC TTACCCCTCCTA和GDEXAAGTGTCATCATCTGAAA；OCN：CTCTCTCTDEXATCACTCTDEXAT和GACTGA GDEXATCCAAGGTAG；Smad1：DEXATTCGTGAA GGGTTGGGG和CGGATGAAATAGGATTGTGGGG；Smad5：TTGTTCAGAGTAGGAACTDEXAAAC和GAADEXATGADEXAAAACTCCTGAT。反应条件：95 ℃，3 min变性；95 ℃，30 s；60 ℃，40 s，共40个循环。

1.3.5Western blot检测ASD对DEXA环境下Smad信号蛋白表达的影响：药物干预14 d后，加入RIPA细胞裂解液300 μL，冰上裂解30 min，12 000 r/min离心10 min，检测蛋白浓度，用等量2-上样缓冲液(2-SDS-PAGE Sample/Loading Buffer)混匀煮沸10 min，提取20 μg的蛋白行SDS-PAGE电泳，将蛋白转至PVDF膜上，室温下封闭1 h，一抗室温孵育2 h后，TBST洗膜3次(10 min/次)，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次(10 min/次)，DAB试剂盒显色曝光拍照。

1.4统计学处理

2 结果

2.1ALP活性

ALP活性见图1。DEXA环境下，小鼠BMSCs ALP活性明显降低(P<0.001)，ASD明显增加了DEXA干预下BMSCs的成骨活性(P<0.01)。

图1 不同干预BMSCs ALP活性Fig.1 ALP activity of BMSCs treated with different methods

2.2茜素红染色

茜素红染色见图2。与单纯成骨诱导比较，BMSCs在DEXA干预下，成骨矿化结节明显减少；与DEXA干预比较，DEXA+ASD干预明显增加了矿化。

2.3不同干预下Runx2、OCN、Smad1、Smad5 mRNA表达水平

图3 mRNA相对表达水平Fig.3 Relative expression levels of mRNAs

不同干预下Runx2、OCN、Smad1、Smad5 mRNA表达水平见图3。与OBI比较，OBI + DEXA干预组Runx2、OCN、Smad1和Smad5 mRNA表达均明显下调(P<0.01)，OBI + DEXA+ASD干预组Runx2、OCN、Smad1和Smad5 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)；OBI +DEXA+ASD干预组较OBI +DEXA干预组Runx2、OCN、Smad1和Smad5 mRNA表达明显上调(P<0.01和P<0.05)。

2.4不同干预下Smad1/5蛋白磷酸化水平

不同干预下Smad1/5蛋白磷酸化水平见图4。与OBI组比较，OBI + DEXA干预、OBI + DEXA + ASD干预小鼠BMSCs后Smad1/5/8总蛋白表达无明显变化；OBI + DEXA干预后磷酸化Smad1/5(pSmad1/5)蛋白表达明显降低，ASD可增加DEXA环境下Smad1/5蛋白的磷酸化水平。

图4 Smad1/5/8和pSmad1/5蛋白表达情况Fig.4 Expression of Smad1/5/8 and pSmad1/5 proteins

3 讨论

糖皮质激素性骨质疏松(glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP)是目前最常见的继发性骨质疏松[1]。其发病机制仍未完全清楚，近期发现DEXA可增加破骨细胞活性，抑制成骨细胞增殖，诱导成骨细胞和骨细胞凋亡，降低骨量[6]。有研究也发现DEXA可抑制大鼠BMSC增殖和成骨分化[7]，这与本研究的结果一致。需要指出，虽然低剂量(或浓度)DEXA可促进成骨分化——在含维生素C(或称抗坏血酸)、β-甘油磷酸盐的成骨诱导剂基础上添加微量DEXA是诱导成骨分化常用的方法，亦有众多研究在诱导成骨分化时未添加DEXA而只添加维生素C、β-甘油磷酸盐[8-10]，本研究中诱导成骨的方法正是参照这些研究。

木通皂苷D(akebia saponin D，ASD)又称川续断皂苷VI，是川续断的主要活性成分，具有治疗抗骨质疏松、糖尿病、高脂血症等药理作用[11]，具有很高的研究和开发价值。虽然已有研究发现ASD可促进BMSCs成骨分化[4, 12-13]，但相关研究仍较少，且ASD对DEXA环境下BMSCs成骨分化的影响及其机制仍未见报道。ALP主要分布在细胞膜，是膜结合胞外酶[14]，协助转运钙，参与细胞成熟、钙化[15], 是成骨细胞分化早期标志物[16]。本研究中，ASD干预DEXA环境下小鼠BMSCs，可明显增强ALP活性，证实了ASD的促成骨分化的作用，与上述既往研究结果类似。

OCN是成骨细胞分化中期的重要标志物[17]，也是调节骨质钙化的重要因子，参与骨组织的正常矿化[18]。Runx2是BMSCs向成骨方向分化的首要决定因子，是成骨细胞分化早期主要骨基质基因表达的启动子[19]。我们的研究结果显示，ASD上调了被DEXA抑制的OCN和Runx2表达，进一步证实了ASD促进成骨分化，提示其机制可能与靶向调控OCN和Runx2的表达有关。

BMP/Smad信号通路是调控成骨的重要通路。BMP受体介导BMP/Smad信号通路转导：磷酸化Smad1、Smad5和Smad8，使其形成复合物并与Smad4结合，转移入核，与其他转录因子如Runx2相互作用，启动成骨相关基因的转录[20]。本研究中，DEXA干预下，Smad1、Smad5 mRNA表达均明显下调，而ASD可上调被DEXA抑制的Smad1、Smad5表达，提示ASD可靶向上调BMP/Smad信号通路中Smad1、Smad5元件表达；另外，DEXA或DEXA+ASD干预，Smad1/5/8总蛋白表达均无明显变化，而DEXA降低了pSmad1/5蛋白水平，ASD增加了被DEXA抑制的pSmad1/5表达，证实ASD可激活被DEXA抑制的BMP/Smad信号通路。

综上所述，ASD可促进DEXA环境下小鼠BMSCs成骨分化，其机制可能与激活BMP/Smad信号通路有关。