RhoA/ROCK信号通路对胚胎干细胞神经分化的影响

黄璟，陈强，伦志刚，金晶，李爱民

徐州医科大学附属连云港医院神经外科，江苏 连云港 222002

干细胞具有自我更新和分化潜能，可以分化为不同类型的细胞。由于干细胞在再生医学上具有重要的临床应用价值，所以近年来，临床对干细胞的研究逐渐深入，尤其是干细胞分化方面的研究越来越被研究者重视。Rho/ROCK在胚胎干细胞分化过程中有重要作用，本文对RhoA/ROCK 信号通路对胚胎干细胞分化的影响进行综述，为胚胎干细胞神经分化的进一步研究提供参考。

1 RhoA/ROCK信号通路

1.1 RhoA 的结构及生物学特定 RhoA 是RhoGTP 酶家族成员之一，RhoA 起着分子开关的作用，在GTP结合的活性构象和GTP结合的非活性构象之间循环。鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)、GTPase激活蛋白(GAP)和鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂(GDIs)这三种蛋白质相互作用并调节RhoA 与GDP 和GTP 结合的转换[1]。在激活期，GEFs 促进结合核苷酸的交换，有利于Rho 蛋白与GTP 结合形式的生成。在非激活期，GAPs刺激Rho蛋白的GTP酶活性，从而将GTP转化 为GDP，Rho 与GDP 结 合，Rho 定 位 在 胞 浆 中。GDIs 能抑制Rho-GDP 与Rho-GTP 之间的转化，有活性的RhoA-GTP 复合体位于细胞膜，而无活性的RhoAGDP-GDI 复合体存在于细胞内液，这三种蛋白质相互作用并调节两种形式的Rho 的转化[2]。RhoA在调节细胞骨架蛋白、细胞形态和迁移以及细胞的各种增殖和转录活性等方面发挥多种功能。c-MYc、HIF1α/2α、Stat6、NF-κB和一些微小RNA等一些转录因子能调节RhoA的表达[3]。RhoA调节细胞骨架动力学和基因表达，两者都控制着干细胞的命运[4]。

1.2 ROCK 的结构和功能 ROCK 属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，是RhoA的关键下游效应器。ROCK有ROCK1 (ROCKβ)、ROCK2 (ROCKα)两种亚型，他们功能各不相同。ROCK 由N 端激酶结构域、Rho 蛋白结合结构域(rho-binding domain，RBD)、PH 结构域(pleck strin-homology domain)和C 端的半胱氨酸富集结构域(cysteine-rich domain，CRD)组成[5]。ROCK 与其他肌动蛋白细胞骨架激酶，如肌强直性肌营养不良激酶(DMPK)、肌强直性肌营养不良相关cdc42结合激酶(MRCK)和citron 激酶具有45%～50%的同源性。ROCK1 和ROCK2 在氨基酸序列上有65%的同源性，在激酶结构域上有92%的同源性[6]。ROCK 通过大量下游靶蛋白的磷酸化来促进肌动蛋白-肌球蛋白介导的收缩力的产生。ROCK 使LIM 激酶(LIM kinase，LIMK)磷酸化，增加LIMK活性，随后促进cofilin蛋白的磷酸化。ROCK 还直接磷酸化调节肌球蛋白轻链(MLC)和肌球蛋白轻链磷酸酶靶亚单位1(MYPT1)磷酸酶，以抑制催化活性[7]。ROCK1主要在循坏炎症细胞中表达，而ROCK2 主要在血管平滑肌细胞中表达。在分布上，ROCK1 主要分布在肺、肝、脾、肾和睾丸，而ROCK2 主要分布在脑、肌肉和心脏[5]。ROCK是肌动蛋白细胞骨架动力学的关键调控因子，磷酸化多种下游靶点，并影响许多对细胞收缩性、运动性、增殖和形态非常重要的细胞内过程，并且ROCK是平滑肌收缩、应力纤维形成、微管动力学、中间纤维组装和局部黏附的主要调节因子。ROCK可以通过影响细胞核内的转录机制来调节基因表达，ROCK 也控制炎症转录因子的表达，包括NF-κB、IRF4、IRF7。ROCK介导的信号传导也可以促进细胞存活[8]。

2 ESCs神经分化的相关因子

2.1 细胞外因子 细胞外因子骨形态发生蛋白(bone morphogenic protein，BMP)、Wnt/β-catenin 和白血病控制因子(leukemia inhibitory factory，LIF)诱导的信号通路在鼠胚胎干细胞的命运决定中起重要作用[9]。BMP属于转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)家族成员，它们与Ⅰ型和Ⅱ型受体组成的异四聚体受体复合物结合，激活具有Smad1/5/8 和Smad4作为关键效应分子的细胞内通路[10]。在鼠ESCs 中，BMP 信号可以通过一系列下游靶点如Ⅰd 和其他基因，通过抑制分化来促进自我更新，BMP4通过刺激双特异性蛋白磷酸酶9 (dual specificity protein phosphatase 9，DUSP9)减弱细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)活性。ERK 已被证明是一种关键的ESC命运调节因子，适当的ERK活性对于降低ESC的多能性和限制其增殖潜能具有重要意义，较高的ERK 活性可促进其分化，而较低的ERK 活性可限制其分化，外源添加的LIF 和自分泌的FGF 信号都能激活ERK，BMP可以抵消LIF和FGF信号对ERK活性的刺激作用[11]。Noggin 可以通过干扰BMP4 与BMP受体结合抑制BMP4信号，Noggin抑制BMP4信号通过激活pax6 和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B，Akt/PKB)信号通路诱导神经分化[4]。在体外，LIF通过激活信号转导子STAT3维持鼠ES细胞处于未分化期[12]。然而，单靠LIF不足以维持鼠ESC的多能性，外源性BMP和LIF信号协同维持小鼠ESC自我更新，而内源性ERK 活性启动分化。在无血清和无血清培养中，来自BMP和LIF的外部信号共同维持小鼠ESC的自我更新，而固有的ERK活性是促进ESC分化的主要触发因素[13]。Wnt/β-catenin 信号在ESC 中有重要作用，无wnt 信号时，细胞质中轴蛋白(axis inhibitor，Axin)的不同区域分别与大肠腺瘤息肉蛋白(adenomatous p01yposis coli，APc)、酪蛋白激酶l (casein kinase 1，CK-1)、糖原合成激酶-3 β (glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)结合形成多蛋白降解复合物。在Wnt配体存在下，Wnts与异基因受体复合物的结合导致破坏复合物的抑制，从而使β-catenin在细胞质中积聚。β-catenin转运到细胞核，在细胞核中充当T细胞因子和淋巴增强因子家族DNA结合转录因子的转录辅助激活因子，调控下游基因的表达[14]。Wnt3a与β-catenin结合Wnt/β-catenin信号与LIF具有相似作用，其可以上调STAT3维持鼠ES细胞处于未分化期，GSK-3β作为wntβ-catenin信号通路降解复合物的重要成员，能够磷酸化β-catenin，促进β-catenin 的降解，GSK-3β抑制剂能够维持ESCs的未分化表型，维持多能性转录因子oct3/4、Rex-1 和Nanog 的表达[15]。因此，LIF、BMP 和Wnt信号在胚胎干细胞分化过程中发挥重要作用。

2.2 细胞内因子 细胞内因子Oct4、Sox2、Nanog对胚胎干细胞的自我更新能力和多能性的维持有重要作用[10，16]。Sox2 属于Sox 家族成员之一，是控制ESC 神经分化的重要调控因子。Sox2 抑制神经祖细胞神经分化，并且Sox2对神经祖细胞自我更新的维持有重要作用，Sox2 在增殖的神经祖细胞中高度表达，并在有丝分裂后向神经元和胶质细胞分化时下调。神经祖细胞中Sox2 信号的抑制阻碍其自我更新和增殖，促进其提前退出细胞周期和终末分化。因此，Sox2的下调是神经分化的先决条件[17]。AP2、Pax6和PROX1可以激活Sox2启动子[18]，在神经祖细胞中，Sox2的表达受PI3K/Akt和STAT3信号调节[19-20]。Oct4也被称为POU5F1，属于POU 家族的转录因子，是ESCs多能转录因子中的关键之一。Oct4在ESCs中过表达与向原始内胚层和中胚层分化有关，而低于正常Oct4 水平的ESCs 仍处于基态，无法向外胚层分化。研究发现，ESCs 中Oct4 的不同表达水平具有四种不同的作用：需要中等水平的Oct4 表达来建立多能性，低水平的Oct4表达加强自我更新，中等水平的Oct4表达允许分化，高水平的Oct4 表达诱导分化[21]。然而，Oct4 并不是唯一控制胚胎干细胞多能性的主基因，在无LIF时，Oct4本身不足以阻止小鼠ESC细胞分化，提示还需要增加新的因子。Nanog是促进ESCs自我更新的“核心转录因子”，其过表达能赋予ESC细胞不依赖LIF的自我更新能力，Nanog的下调可诱导小鼠和人类ESCs向胚胎外系分化[22]。Nanog可能是LIF-STAT3通路维持ESCs多能性的直接下游效应，高水平的Nanog可以绕过LIF维持小鼠ES细胞未分化状态的。

3 Rho/ROCK信号通路在神经分化中的作用

神经突生长是分化神经前体细胞(NPCs)形态极化的第一步，RhoA 和ROCK 是神经突生长的抑制物[23]，Syx可以激活RhoA，缺少Syx可以加速ESC的神经分化。BMP 4 和Noggin 之间的平衡决定了是保持多能状态还是神经分化。抑制RhoA可以增加Noggin的产生，同时Syx-/-的ESC 细胞中Noggin 的表达量是Syx+/+ESC 细胞的两倍[4]，神经分化同时受RA 的影响，Noggin 的产生需要RA 受体RARγ。RhoA 的效应器rhophilin-2(Rhpn2)可以与RARγ结合，敲低Rhpn2基因可以增加Noggin 的表达。表明Rhpn2 与RARγ的结合抑制了RARγ的转录，RhoA 对RAR 有抑制作用。RA 可增加pSmad1 的降解和MAPK 通路的激活[24]，RhoA 可以通过激活ROCK 使Smad 磷酸化，在Syx-/-的ESCs 中有pMAPK 表达增加并且pSmad1 产生减少。Syx-/-细胞的低RhoA 活性增加了RA 向细胞核的穿梭，从而增加了Noggin的产生和神经祖细胞标志物Pax6和其他标志物的转录[25]。

ROCK 抑制剂可以促进骨髓间充质干细胞[26]、脂肪干细胞[27]、胚胎干细胞[28]分化为神经元。ROCK 抑制剂Y-27632可以促进ESC向神经元分化[29]。ERK信号通路在NGF 刺激ESC 神经分化的信号转导中发挥重要的作用，Ras-Raf-MEK-ERK信号通路是影响细胞增殖、存活和分化的重要信号转导系统[30]。ROCK 抑制剂可以通过激活ERK促进ESC向神经元分化，此外PI3K 抑制剂和PKC 抑制剂阻断ROCK 抑制剂对ESC向神经分化的促进作用。已知PI3K 与Cdc42 和Rac的GTP 结合形式结合。因此，PI3K 可能是Cdc42/Rac的下游效应体，PI3K 可与信号蛋白形成复合物，直接调控Ras/Raf/ERK 信号通路各组分的活性。Rac 和Raf 信号可能协同促 进MEK 和ERK 的激活[29]。鸡背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)条件培养基可以促进ESC分化为神经元，此外DRG条件培养基中包含BDNF。在一项研究中报道，联合ROCK 抑制剂Y-27632 以及DRG-CM 对ES 细胞的神经元分化的促进有协同作用[31]，抑制ROCK 可通过PI3K 和ERK 信号促进ESCs神经分化。

4 展望

RhoA/ROCK 信号通路在胚胎干细胞分化中起重要作用，ESCs多能性的维持和分化是由一个复杂的调控网络锁共同组成，其发挥作用的分子机制有待进一步研究。在胚胎干细胞神经分化过程中，RhoA/ROCK信号通路与其他与胚胎干细胞的相关信号通路的作用，联合抑制RhoA/ROCK 信号通路与激活一条或多条其他与胚胎干细胞神经分化相关信号通路能否提高胚胎干细胞神经分化效率，都是未来的研究方向。