阿柔比星降低米托蒽醌引起的细胞死亡的机制

毛 嘉， 周文娟， 潘 洋， 刘 岩

(四川大学生命科学学院， 成都 610064)

1 引 言

在化疗过程中很多时候癌细胞会产生耐药性，这对有效治疗癌症造成了极大的障碍[1]；为了克服这种障碍，临床上时常采用联合用药的方式.但同时使用几种药物进行治疗时，需要考虑药物之间的相互作用，因为它们可能会改变药物的治疗效果.

米托蒽醌(Mitoxantrone，简称MTX)是80年代研制出来的一种蒽环类广谱化疗药，主要用于治疗急性髓系白血病(AML)、恶性淋巴瘤和乳腺癌[2-3]，同时对神经系统疾病如多发性硬化症(multiple sclerosis, MS)也有一定的疗效[4].研究表明，MTX是通过依赖于TOP2产生的双链DNA断裂引起细胞死亡.简单地说，MTX插入DNA双链的碱基对中，促进TOP2和DNA形成稳定的复合物，而该复合物的降解直接导致DNA双链断裂的产生，最终引起细胞死亡[5].如大多数化疗药一样，MTX的治疗效果也受癌细胞耐药性的影响；为了克服这个问题，临床上尝试MTX与其他药物联用，如MTX联合皮质类固醇激素治疗晚期前列腺癌比单独使用MTX有更好的疗效[6].

为了发现更多可以加强MTX作用的辅助药物，我们搜索了在临床上使用的化疗药，我们的筛选条件是：(1)待检药物和MTX的作用机制不同，(2)待检药物可以加强DNA损伤或加强DNA损伤引起的细胞死亡.其中阿柔比星(Aclarubicin, 简称ACL)引起了我们的特别关注.ACL属于第二代蒽环类药物，临床上主要用于治疗AML和恶性淋巴瘤[7].其作用机制与MTX有许多不同之处：(1)ACL通过TOP1产生DNA损伤，而MTX通过TOP2[5]；(2)ACL的作用不受细胞周期的影响，而MTX主要作用于S期和G2期的细胞[8]；(3)ACL还可以从染色体上踢走组蛋白，从而使裸露DNA更容易遭受损伤[9].虽然以上结果都暗示ACL可能会加强MTX的细胞毒性，但另一方面，有报道称ACL可以阻止TOP2和DNA的结合，从而抑制依赖于TOP2的DNA损伤[10].为了明确ACL和MTX联合使用效果，为临床上是否可以联合使用ACL和MTX治疗癌症提供线索，本研究探究了ACL和MTX单独使用或联合使用时对小鼠成纤维细胞L929细胞死亡水平的影响及背后的机制.

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验细胞株 小鼠成纤维细胞系L929购于中国科学院昆明细胞库.

2.1.2 主要试剂 Mitoxantrone(MTX)、DMSO和CsCL均购自Innochem，Aclarubicin(ACL)购自Santa Crutz，CellTiter-Glo®Luminescent Cell Viability Assay试剂盒、DNA定量试剂盒购自Promega；AV/PI凋亡检测试剂盒购自Sangon Biotech；DMEM、双抗、胰蛋白酶购自Thermo Fisher；胎牛血清购自NATOCOR；γH2AX、TOP2 抗体和荧光二抗均购自Abcam.

2.2 方法

2.2.1 细胞存活率的检测 将L929细胞以1∶2接种于96孔板(100 mL/孔)，培养24 h后，细胞密度达到90%；MTX单独处理组每孔分别加入终浓度为0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μmol/L的MTX，ACL单独处理组每孔分别加入终浓度为0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μmol/L的ACL，联合用药组分别加入终浓度为1 μmol/L的MTX 和0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μmol/L的ACL，对照组加入和实验组体积相同的DMSO，每种处理条件设置3个复孔.处理40～48 h后，按照CellTiter-Glo®发光法细胞存活率检测试剂盒的说明书进行检测.

2.2.2 Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡 将L929细胞接种于12孔板中，培养12 h后，细胞密度达到50%，替换培养液为含有MTX(5 μmol/L)和ACL(5 μmol/L)的培养液，阴性对照中加入含有等体积DMSO的培养液.处理30 h后，终止培养，弃去培养液，用0.05%的胰酶消化细胞.37 ℃消化3 min后，将细胞收集到装有培养液的EP管中，800 g/min离心3 min后，弃上清.用500 μL的PBS洗一次，1 000 g/min离心3 min后，弃上清.每组加入195 μL的Binding buffer(1×)和5 μL的Annexin V-FITC，避光，混匀，室温孵育10 min，再加入10 μL Propidium Iodide，用流式细胞仪检测细胞凋亡.

2.2.3 体内酶复合物检测(In vivo Complex of Enzyme Assay, ICE assay) 将L929细胞接种于10 cm培养板上，用ACL(5 μmol/L)预处理细胞2 h，MTX单独处理组和联合用药组再加入MTX(5 μmol/L)，对照组用等体积的DMSO处理1 h后，吸出培养液，在培养板中加入2 mL 1%sarkosyl缓冲液，用18G针头抽吸细胞裂解液3次.在离心管中制作CsCl梯度，从管底部到顶部的浓度：1.45、1.50、1.72、1.82 g/mL，6 mL/层.将裂解的细胞直接加到CsCl梯度上并用石蜡油覆盖.在20 ℃条件下以125 000 g离心22 h.利用蠕动泵通过在离心管底部穿孔收集超离心组分：500 μL/份(DNA通常为第10～20组份).用Nanodrop检测每个组分的DNA浓度并且用DNA定量试剂盒进行准确定量.将每个处理条件的DNA调整为500和1 000 ng(用磷酸钠缓冲液调整体积至100 μL)，通过真空转移到硝酸纤维素膜上，每个处理条件设置3个重复.用强度为120 000 μJ/cm2的紫外线固定转移到硝酸纤维素膜上的DNA，然后将膜放在含有5%脱脂奶粉的TBS溶液中封闭1 h，4 ℃过夜孵育TOP2抗体.第2 d用TBS-T洗2次，每次5 min.二抗室温孵育1 h；然后再用TBS-T洗2次，每次5 min；最后用TBS洗1次，5 min.使用Azure C500凝胶成像系统成像并做灰度值分析.

2.2.4 Western-blotting(WB)检测γH2AX 表达水平 将L929细胞接种在6孔板内，当细胞密度达到90%时，用ACL(5 μmol/L)预处理细胞1 h后，MTX单独处理组和联合用药组再加入MTX(5 μmol/L)处理细胞1 h.用200 μL的Bio-rad Laemmli sample buffer 裂解细胞，然后用12% SDS-PAGE对蛋白进行电泳分离，然后用γH2AX作WB定量检测，采用α-Tubulin作为上样内参.重复3次实验并做灰度值分析.

2.2.5 统计学分析 采用SPSS统计软件进行单因素方差分析，*表示两组之间相比P<0.05，**表示两组之间相比P<0.01，***表示两组之间相比P<0.001.

图2 ACL和MTX单独或联合使用时对细胞死亡率的影响

DM：对照组，MTX：MTX单独处理组，ACL：ACL单独处理组，MA：MTX+ACL联合处理组

Fig.2 The effect of ACL and/or MTX on the rate of cell death

3 实验结果

3.1 ACL降低MTX引起的细胞死亡

为了研究ACL和MTX联合使用的效果，我们分别检测了单独使用MTX，ACL及MTX/ACL联合使用时对L929细胞存活率的影响.结果表明，单独使用MTX(图1A)和ACL(图1B)时，细胞存活率都随着药物浓度升高而降低，但ACL的杀伤效果低于MTX.但当固定MTX浓度(1 μmol/L)时，ACL在一些浓度(尤其是5和10 μmol/L)下表现出明显的保护作用(之后的实验如无特殊说明，所用ACL浓度均为5 μmol/L).为了进一步验证这一结果，我们采用Annexin V/PI双染法检测了ACL，MTX和MTX/ACL引起的细胞死亡水平[11].值得注意的是，由于ACL在荧光素通道会产生自发荧光，在用流式细胞术分析时，我们扣除了ACL产生的荧光值[12].流式细胞计数结果显示：阴性对照组(DM)细胞死亡率为1.22%，MTX处理组细胞死亡率为22.5%，ACL处理组细胞死亡率为3.66%，而ACL和MTX联用组细胞死亡率为10.4%(图2).以上结果清晰表明ACL可以抑制MTX诱导的细胞死亡.

3.2 ACL降低MTX诱发的TOP2-DNA复合物水平

MTX主要通过促进TOP2-DNA复合物形成进一步产生DNA双链断裂(DSBs)而引起细胞死亡[5].因为有研究报道ACL可以阻止TOP2和DNA的结合，从而抑制依赖于TOP2的DNA损伤[10]，所以我们用ICE assay检测了细胞内TOP2-DNA复合物的水平.如图3所示，MTX显著地促进了TOP2-DNA复合物的形成，而ACL可以极大程度地降低该复合物的水平.

3.3 ACL能降低MTX造成的DNA损伤

MTX促进TOP2-DNA复合物形成后会造成DSBs[13]；在DSBs产生后，组蛋白H2AX的C末端139位丝氨酸位点会被磷酸化形成γH2AX，并且其水平与DSBs水平成正相关，故常用来检测DSBs[14].结果表明，相比于MTX处理组细胞，ACL和MTX联用能够显著降低γH2AX蛋白的形成(图4)，表明ACL能够降低由MTX造成的DSBs.

4 讨 论

在癌症治疗中，联合用药的策略在减少化疗药物毒副作用的同时可以提高治疗效果，也减少了对单个药物产生耐药性的可能性.但药物-药物反应不但有累加、协同作用，还可能有拮抗作用[15-16]，因而潜在的联合用药方案，都必须经过严格的实验验证.

MTX是一种具有广谱抗肿瘤活性的蒽环类药物，用于治疗乳腺癌、前列腺癌、急性白血病、淋巴癌等[17-18].ACL是一种同属蒽环家族的化疗药物，应用于急性髓系白血病(AML)和恶性淋巴瘤的治疗，在尝试治疗其他实体瘤时，也取得了一定的效果[19].但如众多化疗药一样，ACL和MTX都面临癌细胞产生抗药性的影响.因为它们通过不同的机制造成DNA损伤，因而我们猜测MTX和ACL联用时可能有更好的效果；但还有研究表明ACL可以插入DNA碱基对之间，阻止TOP2和DNA的结合[5].因为TOP2和DNA的结合是形成TOP2-DNA复合物的先决条件，暗示了ACL可以通过这种机制拮抗MTX引起的细胞死亡.

为了明确ACL和MTX联合使用的作用，我们在小鼠成纤维细胞L929中检测了单独或联合使用ACL和MTX时对细胞存活率和死亡率的影响.我们的实验结果清晰地表明ACL可以抑制MTX引起的细胞死亡(图1，2)，进一步研究揭示ACL通过降低MTX诱发的TOP2-DNA复合物形成(图3)和之后的DNA双链断裂(图4)起到了细胞保护作用.综上，本研究结果暗示了在临床上ACL或许不能和MTX联合使用.