琼脂糖基两性离子聚合物合成及其反聚电解质行为研究

姚芳莲，郭 旗，罗巧悦，田 苗，王进美，胡 剑，杨志伟，李俊杰

琼脂糖基两性离子聚合物合成及其反聚电解质行为研究

姚芳莲1，郭 旗1，罗巧悦1，田 苗1，王进美1，胡 剑2，杨志伟2，李俊杰1

(1. 天津大学化工学院，天津 300350；2. 华东交通大学材料学院，南昌 330013)

分子结构中含有甜菜碱基团的两性离子聚合物，由于独特的反聚电解质性质使其在药物释放、抗蛋白吸附、抗血栓材料等领域具有潜在的应用前景. 但传统两性离子聚合物的可降解性较差，致使其在生物医学领域中的应用受到一定限制. 本文以具有良好生物相容性及生物可降解性的琼脂糖为基本原料，开发了一种琼脂糖和3-[N，N-二甲基-[2-(2-甲基丙-2-烯酰氧基)乙基]铵]丙烷-1-磺酸内盐(SBMA)的接枝共聚物(agarose-g-PSBMA). 首先，通过琼脂糖与溴-异丁酰溴(BIBB)之间的酰胺化反应合成引发剂agarose-Br，探索了BIBB用量、反应时间等参数对agarose-Br取代度的调控作用，结果发现随反应物中BIBB过量倍数的增加，agarose-Br的取代度(DS)逐渐增大. 在此基础上，以agarose-Br为引发剂，通过ATRP反应，实现了SBMA在琼脂糖主链上的接枝聚合. 通过调节SBMA与agarose-Br的投料比例，合成了一系列具有不同取代度及支链长度的agarose-g-PSBMA，且实验结果表明支链的聚合度与投料理论值基本保持一致，相对分子质量分布较窄(1.03＜PDI＜1.30)，接枝聚合的可控性强. 以[]为目标参数，详细并系统地研究了agarose-g-PSBMA在不同NaCl浓度溶液中的反聚电解质行为，发现随NaCl溶液浓度的增加其[]也增大，且agarose-g-PSBMA的[]符合Huggins-Houwink方程的规律，具有明显的反聚电解质行为. 研究结果将为拓宽多糖及两性离子类聚合物结构设计及应用提供新的思路.

两性离子聚合物；原子转移自由基聚合；琼脂糖；反聚电解质

两性聚电解质由于分子链上同时带有正、负电荷两种离子基团，可通过静电作用与盐溶液中的自由离子发生较强的静电吸引作用，从而表现出特性黏数随盐浓度增大而增加的反聚电解质行为[1-3]. 近年来，具有超强吸水功能、良好生物相容性及离子响应性的两性离子聚合物受到研究学者的广泛关注[4-6]. 其在溶液中的反聚电解质行为使其在药物释放、抗蛋白吸附、抗血栓等材料研制领域具有潜在的应用前景[7]. 聚磺酸甜菜碱(PSBMA)具有仿细胞膜结构，价格低廉，易于制备，作为一种代表性的两性离子聚合物，已经在抗菌防污染领域得到了广泛应用. 其在外加盐离子条件下，由于盐离子与PSBMA分子结构中荷电基团间较强的静电作用，使其分子结构中的电荷被屏蔽，进一步导致PSBMA分子链内/链间的相互静电作用大幅降低[8]. 研究人员也发现PSBMA可通过其表面形成的水合层抵抗蛋白质的非特异性吸附，阻止未稀释的人血浆和血清在其表面的非特异性黏附，显著降低细菌的吸附和生物膜的形成[9-10]. 然而，PSBMA的可降解性较差，致使其在生物医用领域中的应用受到一定限制.

本文将具有良好生物相容性及生物降解性的琼脂糖与PSBMA结合，制得了兼具良好生物相容性及抗污染性的琼脂糖基两性离子聚合物，系统研究了所制备的agarose-g-PSBMA在NaCl溶液中的黏度特性，明确了其反聚电解质行为与分子结构之间的内在关系.

1 实 验

1.1 实验原料

琼脂糖(agarose，w＝1×105)，青岛碧水寒天生物有限公司；2-溴异丁酰溴(BIBB)、3-(2-甲基丙烯酰氧乙基二甲胺基)丙磺酸盐(SBMA)，上海阿拉丁公司；三乙胺(TEA)、溴化钠、2，2’-联吡啶(bpy)、4-二甲基吡啶(DMAP)，天津大学科威公司，以上试剂均为分析纯．

1.2 agarose-Br的合成

称取1g琼脂糖加入30mL二甲基甲酰胺(DMF)中．加热至90℃，待其完全溶解后冷却至0℃．将0.1g的DMAP加入配制好的琼脂糖的DMF溶液中，活化1h．加入2mL TEA作为缚酸剂，并将溶解于10mL DMF的BIBB逐滴加入，使反应在室温下进行24h．用冰乙醇沉淀，将沉淀物重复洗涤数次，真空条件下干燥24h，获得大分子引发剂agarose-Br.反应方程式如图1(a)所示.

1.3 agarose-g-PSBMA的合成

将SBMA、agarose-Br及bpy溶于二甲基亚砜(DMSO)中，溶解后将其加入Schlenk管中，在－196℃(液氮)环境中冷冻，并进行反复多次的抽真空-通氮气(N2)操作，并在N2环境下向混合溶液中加入溴化亚铜(CuBr)，再次抽真空，并进行N2置换，密闭反应体系．解冻至室温后反应24h．而后，使用冰甲醇作为沉淀剂，用体积比为200∶1∶1的CH3OH、盐酸和H2O混合溶液反复冲洗沉淀，50℃条件下真空干燥得到琼脂糖基两性离子聚合物agarose-g-PSBMA.其反应方程式和产物结构式如图1(b)所示.

1.4 聚合物性能测试和结构表征

1.4.1 核磁共振分析

将制备的agarose-g-PSBMA溶解于氘代水(D2O)中，质量浓度为10mg/mL，进行核磁(1H-NMR)分析，转动速率为20d/min，扫描150次．根据1HNMR谱图计算agarose-Br的取代度(DS)及agarose-g-PSBMA中侧链的长度(DP)．

1.4.2 凝胶渗透色谱(GPC)

通过渗透色谱(GPC)技术测定制备的agarose-g-PSBMA的重均分子量(w)及其分子量分布(PDI).在测试过程中以NaNO3溶液为流动相，流速为0.5mL/min，标样为PEO．

图1 agarose-Br和agarose-g-PSBMA的合成路线

1.4.3 黏度的测量

将不同条件下制备的agarose-g-PSBMA溶于浓度为0.1～1.0mol/L的NaCl溶液中，用乌氏黏度计测定、计算agarose-g-PSBMA的特性黏数[]，测试温度为(30±0.05)℃，研究其分子结构与反聚电解质行为之间的内在关系．

2 结果与讨论

2.1 agarose-g-PSBMA的合成及表征

众所周知，酰溴与羟基的酰化反应具有较高的反应活性，据此原理，本研究采用TEA作为缚酸剂，合成了不同DS的大分子引发剂agarose-Br．进一步以agarose-Br为引发剂，在CuBr/bpy存在下，以SBMA为单体，通过原子转移自由基聚合在DMSO体系中制备了两者的接枝共聚物(agarose-g-PSBMA)．

在agarose-g-PSBMA的1HNMR谱图(见图2)中，化学位移＝1.93处出现了BIBB中甲基的吸收峰，说明BIBB与琼脂糖之间发生了酰化反应．取d处糖单元上的吸收峰为基准，对c处吸收峰的面积进行积分，计算c处与d处积分面积的比值，即为引发剂agarose-Br的取代度(DS)．此外，从图2中也可以观察到侧链PSBMA中甲基上的H(a峰，＝0.99)，化学位移5.02处的d峰为糖环上O—CH—O处的H，4.12处b峰为糖单元中—CH2—OCO中的质子吸收峰．综上所述，agarose-g-PSBMA的1HNMR谱图中，出现了SBMA中除去双键H以外的所有H原子的特征化学位移，说明SBMA通过ATRP赋予接枝到琼脂糖分子上．

图2 agarose-Br和 agarose-g-PSBMA的1HNMR谱图

2.2 agarose-Br取代度的调控

作为ATRP反应的引发剂，agarose-Br的DS是调控agarose-g-PSBMA支链数的关键因素，也是调节agarose-g-PSBMA接枝聚合物宏观性能的主要因素之一．同大多数多糖类型聚合物相似，琼脂糖本身的溶解性较差，为了提高agarose-Br的取代度DS，最好使其与BIBB的酰化反应在均相体系中进行．本实验首先在加热条件下使琼脂糖溶于DMF中，加入BIBB使两者处于均相体系以提高其酰化效率，实现了通过控制BIBB的投料量控制agarose-Br的DS．如图3所示，随反应物中BIBB过量倍数的增加，agarose-Br的DS逐渐增大，也可通过提高BIBB的加入量，提高琼脂糖分子链上羟甲基的反应程度．当BIBB和琼脂糖糖单元的摩尔比为3∶1时，其DS可达到0.6.

图3 原料组成对agarose-Br取代度的影响

2.3 agarose-g-PSBMA中支链长度的调控

当大分子引发剂DS相同时，可以通过调控反应体系中SBMA单体与agarose-Br的投料比，控制其反应产物中的PSBMA支链长度．据此，本实验合成了一系列PSBMA支链长度不同的agarose-g-PSBMA，表示为：P-Br-g-PSBMA，其中，为agarose-Br的取代度DS，为侧链PSBMA的平均聚合度DPn．例如，将DS为0.6的引发剂agarose-Br溶于DMSO中，加热使其完全溶解．通过调控单体SBMA和引发剂的投料比，合成了SBMA与引发剂中Br的摩尔比为10∶1～60∶1的agarose-g-PSBMA，其重均分子量及分子量分布系数如图4所示．结果发现agarose-g-PSBMA的重均分子量增长趋势基本符合线性规律，此外，所得聚合物的分子量分布较窄，其PDI范围为1.03＜PDI＜1.30．这些特征说明了该反应具有活性聚合的特征．由表1结果可知，agarose-g-PSBMA中支链的长度DPn可通过调节SBMA的加入量来调控，且实验结果与投料理论值基本保持一致，接枝聚合的可控性强．

图4 不同SBMA/agarose-Br投料比条件下agarose-g-PSBMA重均分子量及其分布

2.4 agarose-g-PSBMA的反聚电解质行为

按国标GB 12005.1—89方法，以不同浓度的NaCl水溶液为溶剂，测定agarose-g-PSBMA的特性黏数[]，研究其反聚电解质行为．[]定义为

式中、为经验常数．聚合物的相对黏度可表示为

PSBMA分子链中同时带有—N＋—(CH3)2和—SO3-特征基团，其不同的荷电特征使分子间和分子内具有较强的静电吸引作用．在水溶液中，在这种静电吸引力的驱动下，PSBMA侧链采取较为紧密的分子构象，分子链处于收缩状态．若在溶液中引入小分子盐，其自由的盐离子与PSBMA结构中的N＋—(CH3)2和—SO3-的作用力更强，大量的盐离子被结合在侧链PSBMA上，使其荷电性被屏蔽，极大减小了PSBMA侧链间的静电缔合作用．因此，在NaCl溶液中，Na＋和Cl-破坏了PSBMA结构中正负离子的静电作用，从而导致agarose-g-PSBMA与水分子的作用更强，而使agarose-g-PSBMA分子溶胀，呈现舒展状态分子构象，特性黏数增加．

图5 外推法求样品P-Br0.6-g-PSBMA15在纯水和0.01mol/L NaCl溶液中的特性黏数

如图6所示，当NaCl溶液浓度较低(＜0.1 mol/L)时，agarose-g-PSBMA溶液[]快速升高，而且[]随着盐浓度的增加而增加，体现了典型的反聚电解质特征．主要是由于体系中Na＋及Cl-和agarose-g-PSBMA中侧链两性离子基团之间的较强的相互作用，使PSBMA支链间的静电引力作用逐渐减弱，agarose-g-PSBMA分子链由卷曲状态变为舒展状态，从而使溶液的[]逐渐增大．但是，随着盐浓度继续增大，盐离子浓度相对于两性离子基团的过量倍数明显增加，使大分子链上潜在的结合点越来越少，甚至达到饱和，所以特性黏数的变化逐渐趋于平稳.

支链长度(相对分子质量)也是影响agarose-g-PSBMA聚合物反聚电解质行为的主要因素．根据Huggins-Houwink方程，聚合物的[]随其相对分子质量的增加而增大．这里的研究结果也发现，当agarose-Br具有相同的取代度时，侧链PSBMA聚合度为20的共聚物的[]明显大于聚合度为10的共聚物(见图6)，符合Huggins-Houwink方程的规律．

图6 支链长度、NaCl溶液浓度与agarose-g-PSBMA特性黏数的关系

为了进一步考察agarose-g-PSBMA中支链数目对其反聚电解质行为的影响，实验分别从取代度为0.2和0.6的agarose-Br出发，合成了具有相同支链聚合度(DP＝20)的两种接枝聚合物，并分别测定了其在不同浓度氯化钠水溶液中的特性黏数．如图7所示，agarose-g-PSBMA的[]随引发剂agarose-Br的DS的提高而增大．从图中可以看出，当NaCl浓度相同时，样品P-Br0.6-g-PSBMA20的特性黏数均比样品P-Br0.2-g-PSBMA20大．当PSBMA侧链分子量相等时，随着大分子引发剂DS的提高，PSBMA的支链数量增大，相应的分子链间的静电吸引作用强度得到明显增强，使之相互缠绕明显提高分子链的卷曲程度.在相同浓度的NaCl溶液体系中，支链数量较多的P-Br0.6-g-PSBMA20，PSBMA侧链舒展程度明显大于支链数量较小的P-Br0.2-g-PSBMA20，其[]的增加幅度更为明显，体现出更为明显的反聚电解质行为．相反，NaCl浓度对P-Br0.2-g-PSBMA20溶液[]的调控作用不明显，反聚电解质效应明显弱于Br0.6-g-PSBMA20．

图7 在不同NaCl溶液浓度条件下大分子引发剂取代度为0.2和0.6的agarose-g-PSBMA特性黏数[η]

3 结 语

以琼脂糖为多糖基体，通过与BIBB的酰化反应，成功制得了大分子引发剂agarose-Br．进一步以CuBr为催化剂，bpy为配体，SBMA为单体，通过调节SBMA和agarose-Br的投料比，合成了不同PSBMA支链数量/长度的agarose-g-PSBMA，ATRP的活性聚合特征使其相对分子质量容易控制且分布较窄(1.03＜PDI＜1.30)．系统研究了在NaCl溶液中所制备的agarose-g-PSBMA的取代度和支链长度对黏度的调控作用规律，发现随NaCl溶液浓度的增加其[]也增大，具有明显的反聚电解质行为．其主要是因为大量的Na＋和Cl-通过静电作用结合于PSBMA上，而使PSBMA结构中磺酸根阴离子和季铵盐阳离子的静电作用逐渐减弱．同时验证了agarose-g-PSBMA的特性黏数符合Huggins-Houwink方程的规律．

［1］ Lee W F，Tsai C C. Synthesis and solubility of the poly(sulfobetaine)s and the corresponding cationic polymers：1. Synthesis and characterization of sulfobetaines and the corresponding cationic monomers by nuclear magnetic resonance spectra[J]. Polymer，1994，35(10)：2210-2217.

［2］ Lee W F，Tsai C C. Synthesis and solubility of the poly(sulfobetaine)s and the corresponding cationic polymers：2. Aqueous solution properties of poly [N，N’-dimethyl-(acrylamido propyl)ammonium propane sulfonate][J]. Polymer，1995，36(2)：357-364.

［3］ Lee W F，Lee C H. Poly(sulfobetaine)s and corresponding cationic polymers：3. Synthesis and dilute aqueous

solution properties of poly(sulfobetaine)s derived from styrene-maleic anhydride[J]. Polymer，1997，38(4)：971-979.

［4］ Blackman L D，Gunatillake P A，Cass P，et al. An introduction to zwitterionic polymer behavior and applications in solution and at surfaces[J]. Chemical Society Reviews，2019，48(3)：757-770.

［5］ Xie X，Doloff J C，Yesilyurt V，et al. Reduction of measurement noise in a continuous glucose monitor by coating the sensor with a zwitterionic polymer[J]. Nature Biomedical Engineering，2018，2(12)：894-906.

［6］ 姚芳莲，田欣露，孙 达. 光交联羧甲基壳聚糖衍生物水凝胶的制备及性能研究[J]. 天津大学学报：自然科学与工程技术版，2019，52(5)：508-514.

Yao Fanglian，Tian Xinlu，Sun Da. Preparation and characterization of photo-crosslinking hydrogel of carboxymethyl chitosan derivative[J]. Journal of Tianjin University：Science and Technology，2019，52(5)：508-514(in Chinese).

［7］ Li B W，Yuan Z F，Zhang P，et al. Zwitterionic nanocages overcome the efficacy loss of biologic drugs[J]. Advanced Materials，2018，30(14)：1705728.

［8］ Mary P，Bendejacq D D，Labeau M P，et al. Reconciling low-and high-salt solution behavior of sulfobetaine polyzwitterions[J]. The Journal of Physical Chemistry B，2007，111(27)：7767-7777.

［9］ Dong D Y，Hao T，Wang C Y，et al. Zwitterionic starch-based hydrogel for the expansion and “sternness” maintenance of brown adipose derived stem cells[J]. Biomaterials，2018，157：149-160.

［10］ Ye L，Zhang Y B，Yang B G，et al. Zwitterionic-modified starch-based stealth micelles for prolonging circulation tme and reducing macrophage response[J]. ACS Applied Materials & Interfaces，2016，8(7)：4385-4398.

Synthesis of Agarose-Based Zwitterionic Polymer and Its Anti-Polyelectrolyte Behavior

Yao Fanglian1，Guo Qi1，Luo Qiaoyue1，Tian Miao1，Wang Jinmei1，Hu Jian2，Yang Zhiwei2，Li Junjie1

(1. School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300350，China；2. School of Materials Science and Engineering，East China Jiaotong University，Nanchang 330013，China)

Betaine-based polymer is one of the typical zwitterionic polymers，and its unique anti-polyelectrolyte properties are shown to be potentially applicable in the areas of drug release，anti-protein adsorption, antithrombotic materials，and others. However，the traditional zwitterionic polymer has poor degradability，which limits its application in the biomedical field. In this study，an agarose-graft-poly(3-dimethyl (methacryloyloxyethyl) ammonium propanesulfonate)(agarose-g-PDMAPS)(agarose-g-PSBMA) copolymer was synthesized based on agarose with good biocompatibility and biodegradability. First, the macroinitiator of agaorose-Br was synthesized through the reaction of agarose and bromoisobutyryl bromide (BIBB). Substitution degree (DS) of the agarose-Br was adjusted by the feeding ratio of agarose and BIBB. Results suggested that the DS gradually increases with enhanced BIBB excess multiples. A series of copolymers were then synthesized by ATRP using agarose-Br as an initiator and SBMA as a monomer，varying graft degrees and graft lengths. Results suggested that the molecular weight of agarose-g-PSBMA is consistent with the theoretical values of the feed and the molecular weight distribution is narrow (1.03

zwitterionic polymer；atom transfer radical polymerization；agarose；anti-polyelectrolyte

O636.9

A

0493-2137(2020)02-0201-06

10.11784/tdxbz201902048

2019-02-26；

2019-04-01.

姚芳莲（1968—  ），女，博士，教授，yaofanglian@tju.edu.cn.

李俊杰，li41308@tju.edu.cn.

国家重点研发计划资助项目(2018YFC1105500)；国家自然科学基金优秀青年科学基金资助项目(31722022)；国家自然科学基金资助项目(51573127，31870948).

Supported by National Key Research and Development Program of China(No.2018YFC1105500)，the Excellent Young Scientists Fund by National Natural Science Foundation of China(No.31722022)，the National Natural Science Foundation of China (No.51573127，No.31870948).

(责任编辑：田 军)