五味子不同组分对小鼠免疫性肝损伤的保护作用研究

王晓丽，单莹莹，王佳烨，李正祎，王春梅，李 贺，陈建光，孙靖辉*

(1.北华大学2017级药学研究生班；2.吉林医药学院临床检验基础教研室;3.北华大学药理教研室，吉林 吉林 132013)

肝脏损伤是导致肝硬化和肝癌的前期共同基础，我国目前约有20%以上的人群患有不同程度的肝脏损伤。而在酒精性、化学性和非酒精性肝脂肪病变的发生发展过程中，机体免疫系统的过度应答是导致肝实质损伤的重要诱发原因[1]，因此具有调节机体免疫功能和肝脏保护双重作用的保肝药物具有很好的开发前景。

中药五味子是木兰科植物五味子的成熟干燥果实，具有丰富的药用价值和食用价值[2]。五味子具有广泛的药理活性，其中对于肝脏的保护作用是其主要的功效之一。课题组的前期研究工作表明五味子有效成分对酒精性、化学性和非酒精性肝脂肪病具有明显的保护作用[3- 5]，但对于免疫性肝损伤的研究鲜有报道。为了研究五味子有效成分对免疫性肝损伤的保肝作用，本研究建立卡介苗联合脂多糖导致小鼠免疫性肝损伤的动物模型，观察五味子木脂素和多糖成分对免疫性肝损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

五味子总木脂素提取物(Schisandrachinensislignans,SCL)和五味子总多糖提取物(Schisandrachinensispolysaccharides,SCP)由吉林省五味子开发及产业化科学研究中心制备，其中SCL的提取率1.9%，纯度为93.5%[3]，SCP的提取率为8.6%，碳水化合物含量为40.6%[6]；联苯双酯滴丸购自于北京协和药厂；卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)购于Sigma公司；天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、坏死因子(TNF- α)、谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)、BCA蛋白定量试剂盒、干扰素(IFN- γ)与白细胞介素(IL- 6)测试盒均购于南京建成生物工程研究所。

全自动酶标仪(瑞士TECAN公司)，高速低温冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，FSH- 2型可调匀浆机(西安唯信检测设备有限公司)。

1.2 实验动物

雄性SPF级ICR小鼠，由长春市亿斯实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(吉)2016-0003，体重18～22 g，饲养于12 h∶12 h昼夜循环交替动物室，室温20～24 ℃，湿度45～55度，自由饮食饮水。

1.3 免疫性肝损伤小鼠模型的建立、分组及给药

72只小鼠随机分为6组，即对照组、模型组、阳性药组、SCL组、SCP组、SCL+SCP组，每组12只。适应环境1周后，除对照组外各组小鼠均尾静脉注射2.25 mg卡介苗(对照组注射同体积的生理盐水)，并进行灌胃给药，具体如下：阳性药组给予联苯双酯水溶液20 mg/kg，SCL组给予SCL水溶液(0.2 mg/10 g)，SCP组给予SCP水溶液(0.9 mg/10 g)，SCL+SCP组给予SCL水溶液(0.1 mg/10 g)+SCP水溶液(0.45 mg/10 g)，对照组和模型组给予同体积的蒸馏水。连续灌胃12 d后除对照组外各组小鼠均尾静脉注射80 μg脂多糖(对照组注射同体积的生理盐水)。

1.4 血清生化指标的检测

注射脂多糖8 h后，小鼠称重，摘眼球取血，3500 r/min离心10 min，分离血清，按试剂盒说明书要求测定AST和ALT含量，运用ELISA法测定TNF- α、IL- 6和IFN- γ水平。

1.5 肝脏相关指标的测定

采血完成后，小鼠脱椎处死，摘取肝脏，称重，取肝组织100 mg，加入9倍量的生理盐水制成10%的组织匀浆液，3500 r/min离心10min，取上清液后按试剂盒说明书测定SOD、MDA、NO和GSH水平，计算肝脏指数。

1.6 统计学分析

所得数据均以均数±标准差表示，运用SPSS软件(19.0版)进行分析，组间比较运用单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05代表具有统计学差异。

2 结 果

2.1 各组小鼠肝脏指数和血清ALT、AST的检测

如表1所示，模型组的肝脏指数和血清ALT、AST水平明显高于对照组(P<0.05，P<0.01)，而与模型组相比，联苯双酯组、SCP组、SCL+SCP组的肝脏指数均明显降低(P<0.05)，SCL组虽无统计学差异，但有一定的降低趋势，而各治疗组的AST和ALT水平均明显下降(P<0.05，P<0.01)。

2.2 小鼠肝组织中SOD、MDA、NO、GSH的检测

如表2所示，模型组小鼠肝组织中SOD和GSH水平明显低于对照组(P<0.05)，MDA和NO水平则明显高于对照组(P<0.05，P<0.01)；而与模型组相比，联苯双酯组、SCL组、SCP组、SCL+SCP组小鼠NO和MDA水平显著降低(P<0.05，P<0.01)，SOD和GSH水平显著升高(P<0.05，P<0.01)。

表 1 各组小鼠肝质量和肝脏指数的测定结果

与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01

表 2 各组小鼠肝组织SOD、MDA、NO、GSH水平的测定结果

与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01

2.3 各组小鼠血清中TNF- α、IL- 6、IFN- γ的检测

如表3所示，模型组小鼠血清中的TNF- α、IL- 6、IFN- γ水平明显高于对照组(P<0.05，P<0.01)，而与模型组相比，联苯双酯组、SCL组、SCP组、SCL+SCP组小鼠血清中的TNF- α、IL- 6、IFN- γ水平显著降低(P<0.05，P<0.01)。

表 3 小鼠血清TNF- α、IL- 6、IFN- γ水平

与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；

与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01

3 讨 论

本研究中模型组小鼠的AST和ALT水平明显升高。卡介苗联合脂多糖诱导的小鼠免疫性肝损伤，可以很好地模拟肝炎病症的免疫病理过程,是目前常用的经典免疫性肝损伤动物模型。当卡介苗进入机体后会激活T淋巴细胞，并在肝脏中大量募集巨噬细胞，再次注射脂多糖会导致巨噬细胞活化而产生一系列的炎症细胞因子(TNF- α、IL- 6、IFN- γ)和氧自由基，细胞因子会促进肝脏炎症的发生，而氧自由基则使肝脏出现氧化应激状态，破坏肝脏细胞，导致肝损伤[7]。

AST和ALT存储于肝细胞的胞浆和线粒体中，当肝细胞受到氧化损伤或者炎症刺激时会大量从细胞中释放，是肝损伤的重要临床检测指标。本研究中模型组小鼠的AST和ALT水平明显升高，说明卡介苗联合脂多糖诱导的小鼠免疫性肝损伤模型建立成功。另一方面，大量炎性细胞的聚集、浸润使肝组织肿胀，表现肝脏指数显著增加。而给予五味子各组分后AST与ALT水平明显升高，炎性因子TNF- α、IL- 6、IFN- γ的水平明显下降，其中SCP的作用明显优于SCL，SCP+SCL组略有提升，表明五味子多糖是其产生肝保护作用的主要成分。

肝损伤产生的主要原因为体内活性氧过度激活和脂质过氧化的发生，过量的NO可产生大量的NO合酶，刺激肝脏进入氧化应激状态并促使各炎症因子的释放[8]。MDA为脂质过氧化的最终产物，可严重破坏细胞膜结构，导致细胞肿胀、坏死，能够反映脂质过氧化和细胞损伤的程度。SOD和GSH是生物机体内重要的抗氧化酶，能很好地清除低分子自由基、过氧化氢和脂质过氧化物，二者均具有显著的抗氧化作用。本研究结果显示，五味子各给药组均能显著增加SOD的活性及GSH含量，并显著降低了NO和MDA的含量，其中以五味子多糖最为明显。

课题组的前期研究结果也显示五味子多糖对酒精性和化学性肝损伤以及非酒精性肝脂肪病均有较好的保护作用，而本实验也证实了五味子的有效成分中多糖对免疫性肝损伤的保护作用具有重要意义，而相关的作用机制需要进一步探讨。