安五脂素对D- 半乳糖致衰老小鼠心肌损伤的保护作用及机制研究

刘春娜，王 瑶，张羽翀，袁 瑞，张馨芸，李 欣，陈建光，李 贺

(北华大学药理学教研室，吉林 吉林 132013)

作为机体重要的器官，心脏为机体提供充足血液，使机体各个细胞、器官组织维持正常代谢与生理功能。有研究报道，衰老或其他刺激会引起心脏的氧化损伤[1]，进而影响心脏的正常功能。自由基学说是衰老学说的主要学说之一，从抗氧化角度保护衰老机体的心脏功能是目前研究的热点。安五脂素主要来源于华中五味子，是组成木脂素重要成分之一[2]。本课题组前期研究发现，五味子对衰老小鼠的脑和肝脏具有一定的保护作用[3]，但安五脂素对心脏的保护作用尚无研究。因此，本研究报道安五脂素对D- 半乳糖所致衰老小鼠心脏氧化指标的影响及相关机制，为开发抗衰老的药物及保健品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

安五脂素(纯度≥98%)购自成都普菲德生物技术有限公司；羧甲基纤维素钠(分析纯)购自山东潍坊力特复合材料有限公司；D- 半乳糖购自美国Sigma试剂有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；PVDF膜购自Amersham Hybond公司；过硫酸铵购自Sigma公司；吐温- 20(分析纯)购自天津永大试剂公司；10%SDS购自Sigma公司；脱脂奶粉购自美国BD公司；Tris、Glgcine购自Gentihold公司；甲醇(分析纯)购自天津市汇杭化工科技有限公司；NaCl(分析纯)购自天津市风船化学试剂科技有限公司；Nrf2、血红素氧合酶1(HO- 1)抗体，兔原二抗购自ABolonal公司；RIPA裂解液和BCA试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；台式低速离心机购自eppendorf公司；全自动酶标仪购自瑞士TECAN公司；蛋白质电泳槽购自美国BIO RAD公司；pH计购自METTLER TOLEDO公司；显影仪购自SAGECREATION公司。

1.2 动物分组及给药

清洁级健康ICR雄性小白鼠50只，体重(20±2)g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。小鼠采取分笼饲养，且维持12 h∶12 h昼夜循环，饲料供给充足，自由饮水。

将小鼠随机分为5组，每组10只。空白对照组(CON)：每天灌胃羧甲基纤维素钠溶液及颈后皮下注射生理盐水；D- gal模型组(D- gal)：每天灌胃羧甲基纤维素钠溶液及颈后皮下注射D- 半乳糖(300 mg/kg)；安五脂素低剂量组(AN- L)：每天灌胃安五脂素，皮下注射D- 半乳糖(五脂素1 mg/kg，D- 半乳糖300 mg/kg)，安五脂素中剂量组(AN- M)：每天安五脂素灌胃，皮下注射D- 半乳糖(安五脂素2 mg/kg，D- 半乳糖300 mg/kg)，安五脂素高剂量组(AN- H)：每天安五脂素灌胃，皮下注射D- 半乳糖(五脂素4 mg/kg，D- 半乳糖300 mg/kg)。

1.3 测定方法

小鼠饲养实验结束后，脱颈处死小鼠，取部分心脏组织加入9倍预冷的生理盐水制备10%的心脏组织匀浆，以1200 r/min离心10 min后取上清液，按照试剂盒说明书检测心脏组织的SOD活性及MDA含量。进行蛋白提取，SDS- PAGE电泳，洗膜转膜及封闭。按需求加入Nrf2抗体(1∶1000)，HO- 1抗体(1∶1000)，GAPDH抗体(1∶50 000)，4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗膜3次，每次10 min。再加入GAPDH第二抗体(1∶50 000)，室温摇床杂交1 h后，洗膜3次，每次10 min。最后在PVDF膜上加入ECL显影液，用显影仪进行成像，用Image J软件对蛋白印迹条带进行处理和分析。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 安五脂素对D- 半乳糖致衰老小鼠心脏SOD活性的影响

由图1可知，与CON组比较，D- gal模型组小鼠心脏SOD活性显著降低(P<0.01)，与D- gal衰老模型组相比，安五脂素低剂量组小鼠心脏组织SOD活性升高不明显(P>0.05)，安五脂素中、高剂量组小鼠心脏组织SOD活性显著升高(P<0.05或P<0.01)。

2.2 安五脂素对D- 半乳糖致衰老小鼠心脏MDA含量的影响

由图2可知，与CON组比较，D- gal模型组MDA含量显著升高(P<0.01)，而安五脂素中、高剂量组小鼠心脏组织MDA的含量下降(P<0.05或P<0.01)，安五脂素高剂量组MDA含量高于空白对照组MDA含量。但安五脂素低剂量组D- gal模型组比无显著性差异(P>0.05)。

2.3 安五脂素对D- 半乳糖致衰老小鼠心脏Nrf2及HO- 1蛋白表达影响检测

由图3可知，与CON组比较，D- gal模型组Nrf2含量无显著性差异(P>0.05);与D- gal衰老模型组相比，安五脂素高剂量组小鼠心脏组织Nrf2含量显著升高(P<0.01)；与CON组比较，D- gal模型组HO- 1含量升高(P<0.05)，而安五脂素高剂量组小鼠心脏组织HO- 1含量明显下降(P<0.05)。

3 讨 论

D- 半乳糖诱导的衰老小鼠模型是基于衰老自由基及代谢理论[4]，已经被广泛接受。机体在一段时间内大量注射D- 半乳糖，产生大量自由基，超出机体清除能力，导致脂质过氧化，进一步导致机体器官代谢紊乱，功能障碍等，最终导致机体衰老[5]。本研究前期工作显示，连续皮下注射D- 半乳糖7周，可以成功建立小鼠的亚急性衰老模型。本研究应用该模型[6]观察了安五脂素对该模型小鼠心脏氧化指标的影响。机体过量活性氧(ROS)可使脂质过氧化[7]，最终氧化产物为MDA。因而，MDA含量可直接反应机体脂质过氧化水平，间接反应由于过量的ROS引起细胞损伤程度。SOD是机体重要的抗氧化剂之一[8]，是机体内清除自由基的关键酶类，使机体老化程度得以缓解。

本研究结果显示，与D- gal衰老模型组相比，安五脂素中、高剂量给药组小鼠心脏组织的SOD活性均有不同程度升高，提示安五脂素具有升高SOD活性，增加心脏抗氧化能力的作用。MDA检测结果显示，与D- gal模型组比，安五脂素中、高剂量给药组小鼠心脏组织MDA含量显著降低，提示安五脂素降低了心脏的氧化损伤。

Nrf2是调节机体氧化应激损伤一重要转录因子[9]，当存在氧化应激损伤时，Nrf2进行核移位，快速进入细胞核中[10- 11]，与抗氧化反应元件(ARE)相结合，从而激活Nrf2调控的相关抗氧化酶基因的表达，如激活HO- 1表达，抑制氧化应激作用。HO- 1是Nrf2依赖性基因，有消除ROS作用[12]，本研究结果显示，安五脂素能够上调心脏组织中Nrf2及HO- 1蛋白表达，进而发挥抗氧化作用。

本研究选用低、中、高3个剂量观察安五脂素的相关功能及机制。研究结果显示，与模型组比较，安五脂素中、高剂量组小鼠心脏组织SOD活力及MDA含量及Nrf2、HO- 1的表达有统计学差异，而低剂量组未见差异。提示安五脂素对D- 半乳糖所致衰老小鼠心脏氧化指标的影响可能具有剂量依赖性，其具体的剂量效应关系尚待进一步研究。

综上所述，安五脂素能够升高D- 半乳糖所致衰老小鼠心脏组织中SOD活力，降低MDA含量，该作用与其上调Nrf2及HO- 1蛋白有关。